接上版，其他的血液细胞分离方法

外周血中嗜碱性粒细胞分离方法（Percoll密度梯度离心分离法）

1、Pcrcoll混悬液的配制：Percoll 90ml,HBSS 9ml, HEPES(0.25mol/l)1ml(PH 7.3),HCL(1mol/l)0.4ml 调节至PH7.4；

2、加分层液的顺序：底层先加4ml 1.088g/mlPercoll液，第二层加4Ml1.079g/mlPercoll液，最上层加3ml 1.070g/ml的Percoll液，制成3个密度梯度管，用于分离碱性粒细胞；

3、将新鲜的抗凝血（用0.1mol/EDTA PH 7.7抗凝）按等体积加于Percoll密度梯度分层液上，室温下1200r/min离心25分钟；

4、将每一细胞层分别吸出各放于1支试管内，加无Ca,Mg离子的Hanks液在4度下洗涤3次，每次 1200r/min,离心10分钟弃去上清；

5、将分别得到的各层细胞涂片，固定后用Wright-Giemsa染液染色，在显微镜下检查嗜碱性粒细胞（大多数在中间层，但不同个体嗜碱性粒细胞的密度不同，因此可能会出现在其他细胞层），嗜碱性粒细胞染成紫红色；

外周淋巴血细胞分离（ficoll密度梯度离心法）

1、肝素抗凝静脉血，用Hank’s液约等体积或2倍体积稀释；

2、用滴管轻轻加到 FICOLL上，注意：动作要轻，缓，血液层和FICOLL层的界面要清晰。FICOLL和稀释后的血的体积比甚至可以达到1：4；

3、离心:温度为25 度，2000rpm 20分钟；

4、离心后吸取中间的白色云雾状狭窄带（注意不要吸到FICOLL层），置于另一试管中；

5、加入尽可能多的 Hank’s液洗涤吸取的细胞，1600rpm 8分钟，洗2次；

6、细胞计数，将细胞以一定的浓度种到培养板中，加入营养液培养；

7、分离的时候特别要注意温度，FICOLL和Hank’s液以及营养液使用之前要37度温一下；血液层和FICOLL层的界面清晰；FICOLL离心温度为25度，不能使用离心机上的brake功能。

外周淋巴细胞分离方法

1、5ml 抗凝血缓慢沿壁加到5ml淋巴细胞分离液上（总结经验用15ml的离心管分离最好，如果血开始保存在4度，记得要回温到室温才开始添加）；

2、室温 500g离心20分钟（好像离心时间不能过长，过长又会冲开）；

3、取中间云雾状白色杂带，置于另一50ml离心管中；

4、25ml PBS洗涤（如果混有红细胞，在之前可以用红细胞裂解液，37度裂解5分钟）；

5、1,000 rmp 离心10分钟；

6、重复4和5；

7、2ml 10% 胎牛血清+RPMI1640重悬；

8、计数；

9、调整至10ml后培养；

如果要冻存，用冻存液（10%DMSO+20% 胎牛血清+RPMI1640）4℃,1-2h→-20℃,0.5h（这一步时间不能过长，否则冰晶过大，对细胞有害）→-80℃过夜 ，然后液氮中保存。如果，有那种能一度一度降温的盒子，冻存就好办了。直接按照它的说明做就行了。

单核细胞分离方法

将用等体积生理盐水稀释的抗凝血，加入塑料离心管中的Ficoll Hypaque分离液表面，以450 g离心25min收集单个核细胞，用10 小牛血清的RPMI一1640培养液悬浮细胞，置于6x 6 cm 玻璃培养皿中，在5 ％CO2 、37℃ 下孵育2 h，收集贴壁的单核细胞。用0.2乳白蛋白的RPMI-1 640培养液悬浮单核细胞，Wright染色计数单核细胞<95％，调整细胞密度为4×10／ml。将细胞悬液加入24孔培养板中，在5 ％CO2，37℃ 下培养24 h，离心收集上清液，冻存于一70℃ 冰箱中备用。细胞培养前后台盼蓝染色法测定细胞存活率。

单个血小板的分离和保存

无菌操作下穿刺肘中静脉取血，取用2% EDTA (1∶9)抗凝新鲜血,经100 ×g离心10 min, 获得富血小板血浆( PRP) , 经含1 g/L 牛血清白蛋白(BSA ) 的Hepes Tyrodes洗脱液平衡的Sepharose 2B凝胶柱分离纯化后得血小板沉淀,然后用TEN缓冲液(0. 05mol/L Tris2HCl, 0. 15 mol/L NaCl, 6 mmol/L ED2TA, pH 7. 4)洗涤3次,最后血小板悬浮于TEN缓冲液中,调血小板密度为1 ×109 /ml,加入终浓度为1 mmol/L 苯甲基磺酰氟( PMSF)和1%的Triton X2100,置于4 ℃冰箱过夜,次日10 000 ×g 离心15min,取上清液为血小板破碎液,分装, - 20 ℃保存备用。细胞培养前后用台盼蓝染色法测定细胞存活率 。