中性粒细胞分离的三种方法

一、标准方法：Ficoll-泛影钠（Ficoll-Hypaque）密度梯度及红细胞裂解法

(1）取一50ml聚乙烯管，无菌采集人外周静脉血，加4.4ml3.8%或5%的柠檬酸盐液定容至40ml。上述全血300gX20min，离心，室温。

(2）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制备无血小板血浆（platelet-poor Plasma, PPP）。

(3）余下的沉降全血加入5ml　6%Dextran (分子量500,000，用无菌生理盐水配制)，并用生理盐水（0.9%）调节最终体积至50ml，轻轻、彻底混匀。室温沉降30min。

(4）吸出富含白细胞的上层液，275gX6min。

(5）沉淀的细胞用8mlPPP-生理盐水（1：4）重悬，并移到15ml离心管中。

(6）悬液细胞上面加入3mlFicoll-Hypaque（密度1.077），750gX5min，室温。

(7）吸取富含中性粒细胞和红细胞层，用0.155M　NH4Cl重悬细胞，使红细胞裂解，然后中性粒细胞用含0.25%BSA Hanks平衡液（HBSA，无钙）洗2次，最终用HBSA（含钙）重悬。

(8）用此法可得95%以上的中性粒细胞。

二、不连续的密度梯度血浆－Percoll离心法

(1）先制备Percoll储存液：Percoll原液（100%）:0.9%NaCl的体积比为9：1。

(2）取一50ml聚乙烯管，无菌采集人外周静脉血，加4.4ml3.8%或5%的柠檬酸盐液定容至40ml。上述全血300gX20min，离心，室温。

(3）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制备无血小板血浆（platelet-poor Plasma, PPP）。

(4）余下的沉降全血加入5ml　6%Dextran (分子量500,000，用无菌生理盐水配制)，并用生理盐水（0.9%）调节最终体积至50ml，轻轻、彻底混匀。室温沉降30min。

(5）吸出富含白细胞的上层液，275gX6min。

(6）沉淀的细胞用2~3mlPPP重悬。

(7）在一15ml离心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均为用PPP新鲜配制)、2~3ml细胞悬液，275gX10min。

(8）单个核细胞及部分血小板位于血浆与42%Percoll液之间，中性粒细胞位于42%Percoll与51%Percoll之间。血小板可通过 25%Percoll离心5min去除，也可在原密度梯度中加入第三个25%Percoll一起离心去除。

(9）中性粒细胞层用PPP液冼1次，再用含糖的Krebs-Ringer磷酸缓冲液（KRPD，PH7.23）洗1次。

(10）用这种方法可得80%中性粒细胞，纯度在95%以上。

三、“无LPS”方法（LPS-Free method)

(1）已有用变形细胞（如白细胞）裂解的方法表明，容器及溶液的不含LPS，也就是说，LPS的含量小于 0.1ng/ml。

(2) 无菌采集静脉血，用10%柠檬酸钠抗凝。

(3）抗凝血中加入6%的Dextran(mol wt 70,000)，比例为3：1（vol/vol,blood/dextran），室温，1小时。

(4) 收集白细胞的血浆，离心，去上清。

(5）红细胞用低渗的0.2%NaCl裂解15秒（此步也可用0.155M　NH4Cl　15秒代替）。

(6）离心前立即加入10ml 1.6%NaCl（含糖(dextrose) 2mg/ml）。

(7) 离心后用KRPD洗2次。

(8）此法得到中性细胞数与方法2类似，但纯度只有80-85%，余下为淋巴细胞及单核细胞。

4、从3中所获得的中性粒细胞进行纯化

(1）因为方法3只能获得80－85%纯度的中性粒细胞，可以把方法2与方法3联合对中性粒细胞进行纯化。

(2）收集从方法3 dextran沉降所得到的富含白细胞的血浆，275g*6min，离心。

(3）管底沉淀用2ml PPP重悬。

(4）在一15ml离心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均为用PPP新鲜配制)、2~3ml细胞悬液，275gX10min。

(5）分别用PPP及KRPD各洗1次。

(6）用这种方法所得的中性粒细胞纯度高达99%以上，并且中间不需要红细胞裂解的步骤。

krebs-Ringer phosphate（KRPD缓冲液）的配制：

130 mM NaCl, 5mM KCl, 1.27 mM MgSO4, 0.95 mM CaCl2, 5 mM glucose, 10 mMNaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.4

配制方法：

A液：NaCl　7.5985g ; KCl 0.3727g ; CaCl2 0.1054g，glucose-H2O 0.9495g, 加ddH2O 100ml溶解；

B液：NaH2PO4-2H2O 0.2964g Na2HPO4-12H2O 2.9011g，加100mlddH20溶解后加入MgSO4-7H2O　0.3130g，充分溶解。

将A、B混合，用ddH20将体积调节至990ml左右，用1M NaOH或1M HCl调节pH至7.2~7.4，定容至1000ml。