值得收藏，类器官染色的步骤

做好的类器官该如何染色 ，让它不仅美美哒还符合您实验的要求，按照以下操作来：

冷冻和嵌入:

1.切掉P200ul尖端，将类器官移到1.5ml Eppendorf管中;

2.取出培养基，用1ml PBS洗涤两次;

3.在4摄氏度的摇床上，在冷的4%PFA中固定30分钟;

4.用1ml PBS洗涤三次;

5.向试管中加入1ml 30%蔗糖，在4C下孵育1小时或直 到类器官沉淀到底部;

6.在培养过程中，使用双层铝箔制备模具;

7.制备乙醇：干冰浆;

8.除去蔗糖，用1ml PBS洗涤一次;

9.切断P200尖端的尖端。将P200移液器设定为100ul;

10.在P200尖端涂上FBS。一次捡起所有的类器官，让 它们沉淀到尖端的底部。轻轻地按下移液管节流阀，直到类器官在切割尖端的底部聚集成液滴;

11.轻轻地将液滴接触到铝箔模具的底部。类器官应该粘在一起，你应该使进入模具的PBS的量最小化。如果PBS过多，请使用P200小心去除多余的PBS;

12.切掉P1000的尖端。将900ul OCT/30%蔗糖混合物（2份OCT/1份30%蔗糖）加入含有类有机物的铝箔模具;

13.使用P200尖端，使OCT/30%蔗糖混合物中的类有机物旋转。这稀释PBS并分离类器官彼此分离;

14.将模具放入乙醇中：干冰浆，确保乙醇不会进入模具。OCT应冷冻并在两分钟内变成亮白色;

15.将模具放入24孔板中，在-80摄氏度下储存，直到切片。一旦切片，您可以PFA修复小于5以下。

免疫染色准备：

1.使用PAP笔勾勒各部分的轮廓。让其干燥1-2分钟；

2.在室温下，用4%PFA在玻璃室内固定切片5分钟；

3.在玻璃室中用1X PBS在RT下洗涤3次，持续5分钟；

4.在室温下，在加湿室中封闭/渗透1小时，封闭液配方如下：

a.50ml PBS中的10%灭活的马血清

b.0.38g甘氨酸

c.150ul Triton X-100

d.1滴Image-IT信号增加剂

5.在PBS中的1%灭活马血清中添加第一抗体。在室温下培养1小时或在4C下震荡；

6.在1X PBS+0.05%TritonX-100的玻璃室中洗涤3x5分钟；（a.100 ml PBS，b.500uL 10%TritonX-100）

7.在1%灭活马血清+1:1000 DAPI中加入二抗，在RT下振荡2-3小时；

8.在1X PBS+0.05%TritonX-100的玻璃室中洗涤3x5分钟；

9.在1X PBS中洗涤2到5分钟；

10.拿出进行短暂干燥。向每种类有机物中加入50-100uL的Fluoromount，并加入盖玻片。使用透明的指甲油密封。

开始染色：

1.从培养箱中取出细胞，用1X PBS轻轻洗涤一次（150ul用于96孔板，500ul用于24孔板）。如果细胞没有牢固地附着在培养皿上，则手动抽吸，而不是使用真空；

2.向每个孔中加入4%PFA（对于96孔板为50ul，对于24孔板为400ul），并在室温下孵育15分钟；

3.向每个孔中加入1X PBS（96孔板为150ul，24孔板为1ml）以稀释PFA。然后清洗三次用1X PBS完全去除PFA；

4.加入0.1%Triton（50μl用于96孔板，400μl用于24孔板）使细胞透化并孵育10分钟；

5.去除0.1%Triton，加入封闭溶液（在1X PBS中稀释的10%正常驴血清；50ul用于96孔板，400ul用于24孔板）在室温下搅拌1小时；

6.取出封闭溶液，加入在封闭溶液中稀释的一抗（96孔板30ul，300ul对于24孔板）。在4摄氏度下培养过夜；

7.用1X PBS孔洗涤三次（96孔板为150ul，24孔板为1ml）；

8.加入在封闭溶液中稀释的第二抗体，并在室温下在黑暗中孵育1-2小时；

9.用1X PBS洗涤一次（96孔板为150ul，24孔板为1ml）；

10.加入DAPI溶液（在1X PBS中1:10000；50ul用于96孔板，400ul用于24孔板）并在黑暗中孵育持续5分钟；

11.用1X PBS孔洗涤两次（96孔板为150ul，24孔板为1ml）；

12.样品现在可以成像了。如果细胞在盖玻片上，现在可以将其放置在滑动的镜头下拍摄。