诱导多能干细胞（iPSC）是一种可以产生并提供了一种体外模拟神经组织发育的方法。iPSC特别有趣的分化应用是类似于在人类认知和感觉处理中神经元起着核心作用，神经元活动的缺陷导致了许多疾病，包括癫痫、阿尔茨海默氏症疾病和精神分裂症，IPS诱导神经元该怎么操作呢？
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IPS细胞诱导分化神经细胞操作的protocol
来源：启达生物 浏览量：276 发布时间：2024-01-18
✦一.培养
1. 使用二级生物安全柜，使用适当尺寸的移液管将iPSC在60 mm培养皿中的STEMCult™-XF细胞培养基（启达生物，货号：P2501)中培养。如果从冷冻的iPSC冻存管开始，至少接种300000个细以上。
2. 细胞达到15%-25%的融合度，抽吸用过的培养基以去除未附着的细胞，并检查细胞团块的大小。如果直径约为100-200µm，则其大小适合开始分化。使用5毫升移液管将3毫升在水浴中预热的STEMCult-NDM神经细胞分化培养基（启达生物，货号：P1101)加入培养皿里并轻轻放回培养箱继续培养。如果平板中没有满足100-200um得大小团块，则加入3ml STEMCult™-XF细胞培养基（启达生物，货号：P2501)，每天检查，直到菌落达到合适的大小后才能开始诱导，诱导培养基需要每天换液直到细胞达到完全融合的状态，换液的时候标记出任何非神经分化的细胞团块并用200ul的移液枪去除这些不需要的菌落.
3. 当诱导的细胞密度达到70%以上，将神经诱导培养基的体积增加一倍对细胞营养至关重要。此外，在神经诱导后的第4天至第7天应观察到最小的细胞死亡。如果在神经诱导的第4天至第7天，细胞的颜色变黄，有许多漂浮的细胞，则表明iPSC的起始密度过高。在这种情况下，每天更换神经诱导培养基，去除一些菌落，并将每个孔/板的体积增加一倍。理想情况下，使用这些变量以确保介质不会继续变黄。当达到95%以上开始传代操作.
✦二.传代
1. 从每个待传代的平板中吸出用过的STEMCult-NDM神经细胞分化培养基。
2. 将不含CaCl2和MgCl2的DPBS轻轻添加到每个板中两次，以冲洗细胞。
3. 向每个平板中加入1.5 ml预热0.02%EDTA胰酶，并在37°C下孵育3-5分钟，直到大多数细胞从培养容器表面分离。轻轻拍打平板，使细胞脱落，并加双倍以上完全培养基中和并轻轻吹打。
4. 用移液管将细胞悬浮液转移到15 ml锥形管中。
5. 向每个板加入1ml DPBS以收集残余细胞，并将细胞悬浮液转移到锥形管中。
6. 用5毫升或10毫升的移液管轻轻地上下移取细胞悬浮液3次，以打碎细胞团块。
7. 将细胞以300 x g离心5分钟。
8. 吸取上清液，并将细胞重新悬浮在预热的STEMCult-NDM神经细胞分化培养基中（即，来自每个板的所有细胞为10ml）。
9. 将悬浮在STEMCult-NDM神经细胞分化培养基的细胞平板到10cm培养皿上。
10. 在CO2培养箱中培养细胞2天。在此期间，细胞在培养基中漂浮时会形成聚集。
11. 一旦聚集体达到约70-200µm的适当尺寸，制备一个涂有5 ml Matrigel®的10 cm组织培养皿至少1小时。如果形成的聚集体很少，则将细胞置于60 mm培养皿中。
12. 使用5毫升或10毫升移液管，取下STEMCult-NDM神经细胞分化培养基并通过细胞滤网收集分化的神经细胞。
13. 反转过滤器，将10 ml新鲜预热的STEMCult-NDM神经细胞分化培养基通过过滤器，在过滤器中结合细胞聚集体，将其转移到Procult™ Matrigel基质胶(启达生物，货号：SD0058)涂层的10 cm板上。
14. 在CO2培养箱中培养细胞，使细胞聚集体附着在包被的培养皿上并迁移和增殖。
15. 每2-3天更换一次培养基，直到细胞达到融合，并准备好传代或冷冻保存。在37°C温度下使用温热的accutase细胞消化液室温消化5分钟。
16. 将STEMCult-NDM放置在涂有Matrigel®的组织培养皿上。等待细胞达到70%-95%的融合后再开始分化。
17. 一旦细胞达到所需的融合度，抽吸培养基并用等量的正常神经元培养基代替。
18. 每隔2-3天，吸取培养皿中一半的培养基，并更换为新鲜的正常神经元培养基。
注意：由于培养基会因蒸发而流失，换液的时候尽量要吸干净以维持细胞的生长平衡。
这个培养的阶段NPC细胞的纯度将很容易被检测到。含有高百分比NPC的细胞系将迅速极化并形成神经元投射（通常在2-5天左右），而含有高百分比非NPC细胞（星形细胞、神经嵴细胞等）的细胞系则不会。
✦三.检测
01.显微镜肉眼观察
第5天=细胞细胞铺板形态：细胞分裂后形态
第15天=细胞具有明显极化的轴突和树突，并具有明显可检测的电生理特性，如动作电位
02.免疫荧光染色
1.将细胞种在涂有多聚赖氨酸和层粘连蛋白的玻璃盖玻片让细胞爬满
2.将样品固定在PBS中稀释的4%多聚甲醛（PFA）中。在室温下培养15分钟。
3.在室温下用PBS（3 x 15分钟）洗涤样品。
4.通过在室温下在PBS+0.1%Triton X-100中孵育10分钟来渗透样品。
5.吸取透化缓冲液，用PBS中稀释的5%BSA代替以封闭样品。在室温下培养60分钟。
6.通过在封闭5%BSA-PBS中稀释制备一级抗体的工作储备。不同细胞类型的推荐工作稀释液和抗体见表1。将盖玻片置于一级抗体溶液中，并在2-8°C下孵育过夜
7.在室温下用PBS（3 x 15分钟）洗涤样品。
8.吸取PBS并加入在5%BSA-PBS中稀释的二次抗体。将盖玻片在室温下避光培养一小时。
9.在室温下用PBS（3 x 15分钟）洗涤样品。
10.如果需要，加入在PBS中稀释的DAPI，在室温下孵育5分钟。
11. 在载玻片中加入一滴Vectashield®。小心地使用针头和钳子将盖玻片从细胞侧向下转移到玻片上。用指甲油密封，上机拍照。
03.使用电生理学评估神经元质量
1. 从玻璃毛细管上拔下移液管。当填充内部移液管溶液时，其电阻应在3至6 MΩ之间。
2. 将含有分化的人iPSC衍生神经元的单个盖玻片转移到加热的记录室中，用不含苯酚的神经元培养基连续灌注（1 ml/min），用CO2（5%）和O2（95%）的混合物鼓泡，并使用自动温度控制器保持在35°C。
3. 选择要检测的培养孔。
4. 在移液管中注入内部移液管溶液，并将其放置在电极支架中。降低移液管，将其放入外部溶液中。补偿偏移后，在远程微操作器的帮助下，将移液管接近所选的细胞，以形成高电阻细胞附着密封。
5. 一旦形成密封并建立了整个电池配置，需要80%-90%的串联电阻。
6. 等待5到10分钟后再开始记录。细胞内容物与内部移液管溶液一定要平衡。
对于采集，将滤波器设置为2 kHz，采样率设置为20 kHz。✦
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