肿瘤细胞成球实验

肿瘤干细胞是是一群既具有自我更新能力又具有较强的侵袭迁移的细胞，对肿瘤的存活、增殖、转移及复发有着重要作用。肿瘤细胞的成球实验（成球大小及数目）是衡量肿瘤细胞干性的金标准。

肿瘤干细胞成球实验一般将分选干细胞放在无血清培养基、超低粘附培养皿中进行培养，但也可以细胞系做。恶性程度高的细胞系是很容易成球的，但有的细胞系很困难，所以一般建议用肿瘤干细胞培养，细胞容易成球。

（1）一般选择多大的培养皿，6孔板？

培养皿可以选择6，12，24孔板，也可以选择100 mm培养皿；

（2）接种密度？10000~100000个/ml还是说这个都要靠自己去摸索？有没参考密度？

密度需要自己摸索。低密度常用于原代肿瘤干细胞的提取，筛选可以非粘附生长的细胞。高密度用于细胞球的扩增，一般来说5000个/ml以上的细胞量成球比较好。

（3）怎么换液？

一周加两次完全培养基。以6孔板为例，每次加入500ul，加入后轻轻摇匀，细胞球生长很缓慢，培养基中的生长因子至少能够支持2周以上。直接加入肿瘤干细胞无血清完全培养基，不推荐直接添加的细胞生长因子，确实会影响成球质量。

一旦成球后需要消化传代，细胞球传代需要用弱的消化酶，可使用的是TrypLE Express。据说Accutase和Dispase也可以。消化步骤如下：

• 70μm的细胞筛过滤收集细胞球，TrypLE Express消化。

• 2%BSA溶液终止消化，PBS清洗细胞2次。

• 重悬细胞，计数。

• 用超低吸附的细胞培养板培养细胞（6孔板中每孔加入大约1000个细胞）。

• 培养大约10-14天，观察细胞成球情况并计算SPF。

成球能力是肿瘤干细胞体外鉴定的一个重要方法。其判断的是单个细胞在合适的条件培养基中自我更新的能力，一般用细胞球形成效率（Sphere Formation Efficiency，SFE）表示。

肿瘤球冻存：

1.将离心机调到2000RMP的转速，置入需要离心的球体或者类器官，启动离心机，待转速达到2000后，按下停止键，离心机完全停止后取出离心管，再操做第二步骤）

2.把肿瘤球体吸入离心管中，加入冻存液，冻存类器官或者肿瘤球体请按照冻存细胞的浓度冻存

3.吹匀并置于准备好的冻存管中，请注意此冻存液需要使用程序降温盒降温（置于-20°12个小时后再放入-80°24个小时方可转入液氮）。