星形胶质细胞的分离和提取

形胶质细胞（astrocyte）简称星形细胞、星状细胞，统称星形胶质是存在于脑和脊髓中呈星状的一种神经胶质细胞，它们执行着许多功能，包括对形成血脑屏障的内皮细胞进行生化控制、向神经组织提供营养、维持细胞外离子平衡、调节脑血流量（CBF），以及在修复脑和脊髓因感染或物理伤害形成的损伤、形成胶质瘢痕的过程中发挥重要作用。

星形胶质细胞怎么分离，请查阅上海启达生物给您准备的—鼠源星形胶质细胞的分离步骤:

准备好实验耗材：

各种枪头、电动移液枪、移液管、50ML离心管、100微米细胞滤网、培养瓶/培养皿，滤纸，眼科剪、手术刀片， 离心机，荧光显微镜 , AGM星形胶质细胞培养基,GFAP抗体，PBS，L-多聚赖氨酸、青霉素-链霉素、0.05%EDTA胰酶。

开始进入主题实验：

将新生24小时内的大鼠置于冰上，低温麻醉5分钟；置于75%酒精中浸泡消毒5分钟，眼科剪断头处死，沿脑部正中由后向前剪开皮肤、皮下组织及颅骨至眉心，眼科锻向两侧掀开颅骨，完整取出脑组织，置于滤纸上，手术刀片切除小脑及延髓，沿正中切开两侧大脑半球，去除中脑及海马。刀片拨动大脑皮质，使之在滤纸上滚动一圈，去除脑软膜，将所取脑皮质组织置于冷的PBS中清洗三次.吸尽液体。

①在1ml不完全培养基中，眼科剪反复剪切皮质组织块，约50次，使之成为大小约lmm，小块。

②加入0.05%含EDTA的胰酶15ml,37度消化20分钟，加入2倍体积不完全培养基终止消化。

③3000r/min涡旋60S,500G离心10分钟，弃去上清，加入30ml培养基反复吹打使沉淀重悬。

④300G离心10分钟,弃上清，加入30ml培养基反复吹打，使之重悬。

⑤重复步骤4三次。

⑥经100目细胞滤网过滤后,调整细胞浓度种植于多聚赖氨酸(50ug/ml)包被好的75cm2培养瓶或25cm2培养瓶。

每隔2天全量换液，第二次起每次PBS漂洗两遍，每次换液水平震荡培养瓶约50次。

待细胞生长密度至80%以上，进行免疫荧光鉴定，星形胶质细胞一般采用GFAP-FITC免疫荧光结合 DAPI染色进行星形胶质细胞的纯度鉴定。

即：星形胶质细胞纯度= GFAP阳性细胞数/DAPI阳性细胞数。

小细节决定实验成败，以下点需要多多注意哦：

1、无论分离什么组织，选材注意选取新鲜的组织（不超过24小时)，尽量选取新生三天内的大小鼠。取材过程尽可能保证无菌，尽量剔除脑膜及血管和海马部分。

2、注意尽可能消除脑组织表面的残血，避免血细胞及某些血清成分对胶质细胞贴壁的影响。

3、应严格掌握好酶的消化浓度和消化时间。

4、严格控制胶质细胞培养条件，包括细胞培养用液（培养基，生长因子，血清，抗生素）的质量，浓度，可直接选用启达生物星形胶质细胞培养基AGM（启达生物，货号：P2701），省时省心，成品配制，直接添加即可。

5.包被液多选择多聚赖氨酸，浓度为25-50ug/ml，因为多聚赖氨酸本身的化学性质，使用过高会导致细胞死亡