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一文搞定内皮细胞损伤模型操作
来源：启达生物 浏览量：119 发布时间：2026-08-06
内皮细胞损伤模型有：细胞因子损伤模型,双氧水损伤模型、氧自由基损伤模型、氧化型脂蛋白损伤模型、等等
一、内皮细胞的应激损伤模型：
1、过氧化氢（H₂O₂）是建立内皮细胞氧化应激损伤模型最常用的化学诱导剂之一，可模拟体内活性氧（ROS）过量导致的血管内皮功能障碍,浓度和时间是模型成败的关键.
操作开始啦：
步骤1：细胞培养
1、取对数生长期内皮细胞，以适宜密度接种于培养板（如96孔板 5×10³/孔，6孔板 1×10⁵/孔）
2、37°C、5% CO₂培养箱中培养至细胞贴壁（通常12–24 h）
步骤2：预实验筛选最佳浓度
1、设置H₂O₂浓度梯度：0、100、200、400、600、800、1000 μmol/L
2、设置时间梯度：6 h、12 h、24 h、48 h
步骤3：检测
采用 CCK-8法或MTT法 检测细胞存活率，存活率降至 50%–70% 的浓度-时间组合最佳，浓度过低损伤不明显，浓度过高导致不可逆坏死，不利于后续药物干预研究。
H₂O₂实验操作不要忽略的细节：
H₂O₂现配现用：H₂O₂不稳定，需用PBS或培养基新鲜配制，避免反复冻融
血清影响：血清中的过氧化氢酶可降解H₂O₂，部分实验采用无血清或低血清培养基
细胞密度：密度过高会抵抗氧化损伤，密度过低则易全部死亡，需保持一致
作用时间：急性损伤（30 min–6 h）主要反映直接毒性；慢性损伤（24 h）更接近病理状态
衰老模型特殊处理：200 μmol/L H₂O₂处理25 min需采用悬浮孵育法（离心后PBS重悬，翻转混匀），处理后需PBS清洗再接种培养.
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二、ox-LDL 的模型建造方法
1、制备ox-LDL
准备：人血浆低密度脂蛋白（LDL，购自公司或自行分离）、CuSO₄（分析纯）、PBS（pH 7.4，含 0.01% EDTA）、氮气。
步骤 | 操作 |
1. LDL 准备 | 将 n-LDL 溶于 PBS（无 EDTA），调整蛋白浓度至 200–500 μg/mL |
2. 氧化诱导 | 加入 CuSO₄ 至终浓度 50–100 μmol/L（常用 50 μmol/L） |
3. 氧化条件 | 37°C 水浴振荡孵育 16–24 h |
4. 终止氧化 | 加入过量 EDTA（终浓度 100 μmol/L）螯合 Cu²⁺ |
5. 透析除盐 | 4°C 透析（PBS，pH 7.4）24–48 h，每 6–8 h 换液 |
6. 除菌过滤 | 0.22 μm 滤器过滤，分装保存于 -80°C |
7. 充氮保护 | 分装后充氮气密封，避免反复冻融 |
2、ox-LDL模型建立步骤：
ox-LDL 浓度选择：80–100 μg/mL
样本数：空白对照组、模型组、若需要加入药物检测，需准备阳性药对照组和给药组
处理时间：24小时
处理条件：处理前换用 无血清或低血清（1–2% FBS）培养基培养12–24 h，再加入 ox-LDL 继续孵育24-48小时。
ox-LDL模型验证：
采用CCK-8 法、LDH 流式、氧化应激检测、炎症反应检测及内皮功能检测等。
OX-LDL实验操作不要忽略的细节：
ox-LDL 来源：可购买商品化 ox-LDL（如 Sigma、Yiyuan Biotech），也可自行用 Cu²⁺ 氧化天然 LDL 制备，但需测定 MDA 含量以确认氧化程度。
避免血清干扰：处理时尽量使用无血清培养基，血清中的抗氧化剂可能减弱 ox-LDL 损伤效应。
浓度敏感性：不同批次 ox-LDL 活性差异大，务必在正式实验前做预实验筛选最佳浓度。
细胞代次：细胞传代过多可能会导致细胞特性改变，建议使用低代次细胞。
