血管新生，这些检测方法你知道吗？

血管新生（Angiogenesis），又称为血管生成或血管发生，是指在原先存在的血管的基础上生出新的血管的生理学过程，血管新生主要存在于内皮细胞的分裂和增殖种，血管新生有多少种检测方法？以下是从一篇文献中找到的31种检测方法。

以下是两种常用的血管新生的实验检测操作步骤：

1.MTT法检测内皮细胞活性

贴壁细胞 

1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入 100ul,铺板使待测细胞调密度至 1000-10000 孔，（边缘 孔用无菌 PBS 填充）。 

2.5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96 孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后 即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般 5-7 个梯度,每孔 100ul,设 3-5 个复孔.建议设 5 个，否则难以反应真实情况 。

3.5%CO2，37℃孵育 16-48 小时，倒置显微镜下观察。 

4.每孔加入 20ulMTT 溶液（5mg/ml，即 0.5%MTT），继续培养 4h。若药物与 MTT 能够反应，可先离心后 弃去培养液，小心用 PBS 冲 2-3 遍后，再加入含 MTT 的培养液。 

5.终止培养，小心吸去孔内培养液。 

6.每孔加入 150ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值。

7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、 MTT、二甲基亚砜）。

悬浮细胞：

1.收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度 1×106/ml，按次序将

①补足的 1640（无血清）培养基 40ul ；

② 加 Actinomycin D（有毒性）10ul 用培养液稀释 lg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；

③需检测物 10ul； 

④细胞悬液 50ul（即 5×104cell/孔），共 100ul 加入到 96 孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加 100(储 存液 100 1640）。 

2.置 37℃，5%CO2 孵育 16-48 小时，倒置显微镜下观察。 

3.每孔加入 10 ul MTT 溶液（5 mg/ml，即 0.5%MTT），继续培养 4 h。（悬浮细胞推荐使用 WST-1，培养 4 h 后可跳过步骤 4），直接酶联免疫检测仪 OD570nm（630nm 校准）测量各孔的吸光值）。

4.离心（1000 转 x10min），小心吸掉上清，每孔加入 100 ul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡 10 min，使 结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 OD570nm（630nm 校准）测量各孔的吸光值。 

5.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、 MTT、二甲基亚砜），每组设定 3 复孔。

二、内皮细胞的成管实验操作步骤：以HUVEC细胞为例

提前预冷分装基质胶所需要的耗材，在冰上4°C 解冻基底膜基质，解冻后使用酒精擦拭消毒，置于冰上分装或者操作，使用前摇匀。

A. 从靶细胞系制备条件培养基

1. 为了制备条件培养基（CM），接种靶细胞并生长至30-40%汇合（取决于细胞系的生长速率），用无血清DMEM（例如，对于T75组织培养瓶为10ml；抗生素的存在与否无关紧要）

2. 代替生长培养基24小时，然后当细胞在T75组织培养瓶中达到60-80%汇合时收获CM。

如果收集CM后未立即使用，则取0.5 ml CM等分试样，并在-80°C下储存。

B.人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞的制备 

1. 按照培养基配比要求配好ECGM完全培养基。

2. 根据需要将HUVEC细胞接种在T25或T75培养瓶中，使其达到70-80%的融合。

3. 在不含抗生素的培养基200PRF中进行试管形成测定之前，去除血清使HUVEC细胞饥饿3-6小时（例如，对于T25组织培养瓶为5毫升）。

注：在血清饥饿结束时，转至程序C步骤1。

4. 在用生长因子减少的基质胶涂布96孔板后，用胰蛋白酶从烧瓶表面去除细胞，用DMEM与血清中和，在室温下以1200rpm（276xg）离心3分钟使细胞沉淀，重悬于2-3ml无血清DMEM中，通过计数细胞来测定HUVEC的浓度，并通过向上和向下吸移几次以4×105/ml无血清DMEM重悬HUVEC细胞，以确保均匀的单细胞悬浮液。

 注：对于生长因子减少的基质胶，应尽可能减少解冻/冷冻周期。

5. 在将500μl HUVEC细胞悬浮液移液到1.5 ml试管中的同时充分混合。使用台式离心机以4000rpm（1100rcf）的转速将细胞降速3分钟。在不干扰细胞沉淀的情况下小心地吸出上清液。尽可能多地去除上清液。根据要使用的靶细胞系的数量，在1.5ml试管中制备适当数量的HUVEC细胞。

 注：每个靶细胞系CM将悬浮一管HUVEC，每个悬浮的HUVEC将分配3个一式三份的孔。因此，每个靶细胞系总共将使用3个孔。

6. 解冻从程序a步骤2收集的0.5ml等分的目标细胞系CM，并用胎牛血清将其补充至1%的最终浓度，以在程序B步骤5中重悬HUVEC细胞颗粒。

 注：每个靶细胞系应一式三份（每个孔需要100μl HUVEC细胞悬浮液）。

C . 用生长因子减少的基质胶（启达生物，货号SD0054）涂覆96孔板

1. 使用前一天在4°C下解冻适当体积的基质胶。

2. 将96孔板和移液管尖端在-20°C下预冷2-3小时。

3. 在HUVEC细胞血清饥饿接近尾声时，在计数HUVEC之前，在冰上预冷96孔板的每孔中，等分试样50μl的基质胶。旋转铺板，直到凝胶均匀地分布在整个孔上。避免气泡的形成是非常重要的。使其在室温下在水平表面上聚合1小时。

D. 将HUVEC细胞分配到涂布的96孔板上

1. 将100μl程序B步骤6中获得的HUVEC细胞悬浮液完全混合到96孔板的标记孔中。将平板在37°C、5%CO2下培养4-6小时。

2. 用光学显微镜观察细胞。拍摄毛细管网络的图像，并使用Scion Image软件计算管道长度。