不同肿瘤的成纤维细胞分离protocol

肿瘤微环境和癌症相关成纤维细胞尤其表现出其正常对应物中不存在的肿瘤促进能力（Calvo等人，2013；Hanahan和Coussens，2012）。因此，对肿瘤进展过程中成纤维细胞中发生的修饰进行功能和分子表征对于充分了解它们在肿瘤进展中的作用至关重要。

一、乳腺或脂肪组织提取成纤维细胞方法：

1. 对于正常的乳腺组织，用眼科剪剪成1mm的碎片放入6CM培养皿中，再压上20毫米的盖玻片，以防止脂肪组织漂浮，然后慢慢添加准备好的FGM成纤维培养基（启达生物，货号：P6001)，此培养基在提取细胞的时候需要把血清提高到10%, 培养基中含有小分子化合物抑制杂细胞生长，添加成纤维细胞生长所需蛋白，使用FGM成纤维细胞培养基可提高细胞活性和纯度。

使用此方法需要注意以下几点：

1.培养基一定要缓慢添加，以避免玻片悬浮起来；

2.样品需要与塑料和盖玻片接触，才能使成纤维细胞从样品中出来;

3.7天后若观察到大批成纤维细胞从组织中进入盖玻片和培养皿，可以转移到新的培养皿中。

采用组织贴壁法提取的成纤维细胞

二、对于乳腺增生、腺瘤和癌组织样本提取成纤维细胞的方法：

1.准备好浓度为1mg/ml胶原酶溶液和含有10ug/ml的DNase 1完全培养基；

2.将分离的组织放入装有适量胶原酶/分散酶的无菌管中。用移液管反复吹打几次以帮助分解，然后将样品在37°C和180 rpm的轨道振荡器中孵育60分钟，一般每个样品使用2-3毫升（250-500毫克组织）。根据样本大小进行调整。

3.将一体积的含有1mM EDTA的PBS添加到每个样品中，反复吹打数次；

4.使用3mm过滤器过滤样品也可采用其他方法（橡胶注射器柱塞等）或者在室温以100 x g离心5分钟（此步骤主要去除未消化的组织块。)

5.弃上清，用完全培养基洗涤过滤下来细胞的颗粒，并再次在RT下以100×g离心5分钟。

6.将含有颗粒的细胞在RT下与完全培养基加DNase 1（最终浓度为10µg/ml）孵育10分钟。

7.重复步骤5两到三次。

8.离心后弃培养基，将细胞重悬在完全培养基中并接种在T25或T75瓶中(根据离心下来的细胞量进行安排一般一个T25不能低于5*10^5cell），放入培养箱开始培养。

9.30分钟后，采用时差贴壁法对提取的细胞进行第一次换液，（此时需要更换成含有2%FBS正常的FGM培养基）换液时用预热的PBS轻轻洗涤一次，并将其放回培养箱中

10.在含有2%FBS的 FGM中培养3-5天后，大部分成纤维细胞可生长至80%以上，此时可按照正常方法冻存或者传代即可。

酶消化提取的成纤维细胞

启达FGM成纤维培养基(启达生物，货号：P6001）参考文献：

1.Structural and biofunctional evaluation of decellularized jellyfish matrices，DOI;https://doi.org/10.1039/D3TB00428G

2.Collagen from Iris squid grafted with polyethylene glycol and collagen peptides promote the proliferation of fibroblast through PI3K/AKT and Ras/RAF/MAPK signaling pathways，https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2023.125772