1、机械刮除法
用不锈钢丝末端的橡胶刮头(用胶塞剪成三角形插入不锈钢丝)或裹上少许脱脂棉制成，装入试管中高压蒸气灭菌后备用(也可用特制电热烧灼器刮除)。程序如下：
(1)标记,显微镜下观察，用记号笔在培养瓶(皿)的背面圈下需要的肿瘤细胞的部位。
(2)刮除弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶(皿)中，在肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记细胞空间。
(3)Hanks液冲洗1～2次，洗除被刮掉的细胞。
(4)加入培养基继续培养，如仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至彻底刮净为止。
2、反复贴壁法
根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离。方法如下(同贴壁传代)：
(1)待细胞生长达一定数量后，倒去旧液，用0.25%胰蛋白酶消化后，Hanks液洗2次，加入不含血清的培养液吹打分散，制成单细胞悬液。
(2)取三个培养瓶分别编号为A、B、C，首先把细胞悬液接种入A瓶，置温箱中静置培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后，慢慢吸出全部培养物，再接种于B瓶中，然后向A瓶中补充完全培养基置温箱继续培养。
(3)B瓶中的细胞静置培养5～20分钟后，按处理A瓶的方法，把B瓶中的培养液和细胞悬液吸出并注入C瓶中，再向B瓶补加完全培养基，C瓶补加少量小牛血清(浓度为10%)。
三个瓶一并在培养箱中培养，如操作成功，次日观察，可见A瓶中主要为成纤维细胞，B瓶中两类细胞混杂，C瓶中主要为上皮细胞(癌细胞)，必要时可反复处理几次直至癌细胞纯化为止。
3、消化排除法
(1)先是用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培养细胞一次，然后加入新的混合液继续消化直到有半数细胞开始脱落时，立即停止消化。
(2)把消化液离心弃去上清，沉下的细胞用培养基重悬并吸入另一培养瓶中，置温箱培养，向原瓶中补加新的培养基继续培养，此法处理后，鉴于成纤维细胞比肿瘤细胞先脱落，原瓶中留下的多为肿瘤细胞，经过几次反复处理，就能把成纤维细胞除净。
4、胶原酶消化法
本法是利用成纤维细胞对胶原较为敏感的特点，通过消化进行选择。
(1)可用0.5mg/mL的胶原酶消化处理，边消化边在镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后即终止消化。
(2)用Hanks液洗涤处理一次后，更换新培养基，继续培养，可获纯净肿瘤细胞，若未清除净，可再次重复。
5、密度梯度离心法
用泛影葡胺和聚蔗糖配制成比重1.025～1.085的密度梯度分离液，加入细胞悬液后，2500r/min离心10分钟，在比重1.025～1.050层为成纤维细胞，在比重为1.065～1.085层为上皮细胞，将收集的上皮细胞经洗液3次后，进行培养可获纯净的肿瘤细胞。在提取的时候加入适量的SOD也可抑制成纤维细胞的生长。
启达生物肿瘤细胞成球培养基是一款无血清，无动物组分干扰的细胞株及原代肿瘤干细胞皆可成球的培养基；经检测和验证有以下4大特点：
1. 大部分肿瘤细胞株可直接使用TSCM成球
2.可培养复杂的球体和类器官
3.可维持同质肿瘤球的传代和扩增
4.无血清无动物源蛋白组分，可保持实验的统一性和可验证性。
