适用于各种微血管内皮细胞的提取方法与磁珠筛选法

小鼠的微血管内皮怎么提取和分离，以下是我们技术整理的资料，15只小鼠换来的经验之谈，您有更好的操作方法吗？欢迎后台留言大家一起讨论.

准备好ECGM内皮细胞培养基（为了防止污染，可使用三抗进行初代培养)（启达生物：P1001）、细胞包被液（启达生物： SD0044)含有2.5%FCS加三抗的PBS,磁珠抗体，细胞筛，胰蛋白酶，眼科剪，等等

1. 使用过量的异氟烷对老鼠实施安乐死。最好在一分钟内导致老鼠呼吸停止，时间太长会产生缺血灌注反应，导致提取的细胞内血液细胞太多，正常内皮无法获取营养繁殖。  

2. 使用高压灭菌仪器尽可能无菌地去除小鼠的心脏、肺和肝脏等器官，并在加入2X双抗的PBS中冲洗以去除血液。 

3. 在培养皿中，使用无菌交叉手术刀，将需要提取的组织解剖成2mm³块。 

4. 通过低速离心（210 x g，1分钟）在PBS中洗涤两次。 

5. 在37°C的潮湿培养箱中，将切片组织在胶原酶2溶液（0.5 mg/ml）中培养1小时。

注：我们使用Gibco®II型胶原酶，因为与其他胶原酶制剂相比，它具有更高的梭菌蛋白酶活性，非常适合消化心脏、骨骼、甲状腺、软骨和肝脏组织。

6. 随后，每10 ml细胞悬浮液添加75µl DNase I溶液，并在37°C水浴中连续搅拌再孵育30分钟。 

7. 将消化后的组织通过细胞过滤器，以去除未消化的块。 

8. 用补充有2.5%FCS并且加双抗的PBS冲洗细胞滤网两次，以收集任何剩余的细胞。 

9. 在0.25%胰蛋白酶（每100mg组织用1ml胰蛋白酶）中再孵育10分钟，获得单细胞悬浮液。 

10. 在补充有2.5%FCS的500µl PBS中洗涤一次。 

11. 用鼠免疫球蛋白在4°C下孵育30分钟以阻断Fc受体。

注：小鼠BD-Fc块是纯化的大鼠IgG2b抗小鼠CD16/CD32单克隆抗体。

12. 在补充有2.5%FCS的冷PBS中洗涤两次。 

13. 与大鼠抗小鼠CD31、大鼠抗鼠CD105和生物素化的隔离蛋白B4在4°C下孵育45分钟。 

14. 在补充有2.5%FCS的冷500µl PBS中洗涤两次，并计数细胞。 

15. 重新悬浮颗粒，并与PBS 2.5%FCS（200μl/l，2.5 x 107细胞）、大鼠抗小鼠Ig（25μl/l、2.5 x 107个细胞）和链霉亲和素结合的微珠（25μl/l，2.5×107细胞）在4°C下孵育15分钟（总体积250μl）。同时，将色谱柱加载到分离装置上（每1-2.5 x 107个细胞使用一个色谱柱），并按照制造商的说明用500μl PBS 0.5%FCS清洗每个色谱柱。 

16. 将250μl细胞悬浮液装入每个柱中。磁性标记的细胞保留在柱中，而未标记的细胞通过。细胞悬浮液流过柱后，用500μl PBS 0.5%FCS洗涤柱两次。不同品牌的仪器请参阅仪器制造商网站上的视频或者说明书。 

17. 将柱从磁铁上卸下，并使用提供的柱塞用PBS 0.5%FCS洗脱磁性保留的细胞。 

18. 洗涤洗脱的细胞，以200 x g离心5分钟。（在第一铺板的时候，ECGM培养基的血清浓度可提高到10%左右），（10^5cell/ml）中再悬浮，并在用包被液预涂的培养皿或者培养瓶中培养。因ECGM培养基配方采用小分子化合物抑制杂细胞生长，采用蛋白诱导内皮细胞生长，可以让得到的内皮细胞传代更多并且纯度也更高，培养15天发现在任何阶段都没有观察到非内皮来源的污染细胞的过度生长。此方法提取和培养微血管内皮纯度在95%以上。