原代肿瘤提取和培养protocol

肿瘤细胞原代培养是一种常用的实验方法，用于研究肿瘤细胞的生长、分化、转移等生物学特性。原代培养是指从肿瘤组织中分离出的细胞在体外培养的第一代细胞，具有与原始肿瘤组织相似的生物学特性，是研究肿瘤生物学的重要工具。

一、准备试剂：

磷酸盐缓冲盐水（PBS）(启达货号：SD0029),胎牛血清（需灭活）(启达货号：SD0200),胰蛋白酶，Hepes(启达货号：SD0009)，MEM基础培养基(启达货号：MD0300)，B-27细胞添加剂(启达货号：SD0011)，PSN抗生素(启达货号：SD0034)，多聚赖氨酸(启达货号：SD0042)

二、肿瘤细胞提取步骤：

1. 进行肿瘤的离体大体全切除，在定性滤纸上去除血水以及包膜，使用眼科剪在少量的PBS中将组织切碎。

2. 在37°C的振荡浴中，用每种样品11 ml的消化酶（在含有20mM HEPES的MEM中，胰蛋白酶2.5%的1:1000稀释液）处理切碎的组织30分钟。消化后，通过70µm筛网过滤分离的细胞。

3. 加入5毫升10%热灭活的FBS使胰蛋白酶失活。以450 x g离心细胞10分钟，然后重新悬浮在含有20mM HEPES和10%的FBS的MEM中。

4. 将细胞以300X g离心20分钟，然后重新悬浮在培养基中。

将肿瘤细胞平铺到用聚-L-赖氨酸（0.1mg/ml浓度）以每孔200万个细胞的浓度涂布的6孔组织培养板上。

5. 使用相对应的培养基加10%FBS,1%B-27 和1%PSN培养细胞（原代肿瘤细胞培养以DMEM高糖和McCoy's 5A基础最为常见），并按照细胞生长特性补加生长因子

6. 从在基础培养基中维持48小时的肿瘤细胞系的融合培养物中收集该肿瘤细胞条件培养基。

三、注意细节，原代肿瘤细胞培养就是这么简单：

(1)培养材料应取自肿瘤细胞集中、活力较好的部分，取材后应立即培养并存放于培养液中。

(2)取材和培养过程中要防止细菌和霉菌污染。

(3)培养物中混有的成纤维细胞要尽快清除。

(4)癌组织中若有淋巴细胞浸润，应采用梯度离心法将淋巴细胞清除，否则癌细胞会被杀死。

(5)实验要防止其他细胞株的交叉污染。

(6)当癌细胞没有生长到足够的量时，应耐心等待，坚持换液，不要急于传代。

(7)癌细胞经常重叠生长，如果混有成纤维细胞，应在传代时采用消化消除法及反复贴壁法加以清除，分离出癌细胞进行传代培养。

(8)在传到10代前细胞生长繁殖极不稳定，传代要小心，该合并培养时还得合并，千万不能传代。要确定适合该细胞的培养方法。

(9)在早期传代时要适当提高接种浓度。

(10)消除成纤维细胞始终为癌细胞培养中的重要条件，一旦发现应尽早尽快按上述介绍的方法加以清除。

参考文献：

1. Canoll, P. D., Musacchio, J. M., Hardy, R., Reynolds, R., Marchionni, M. A. and Salzer, J. L. (1996). GGF/neuregulin is a neuronal signal that promotes the proliferation and survival and inhibits the differentiation of oligodendrocyte progenitors. Neuron 17(2): 229-243.

2. Gensert, J. M. and Goldman, J. E. (2001). Heterogeneity of cycling glial progenitors in the adult mammalian cortex and white matter. J Neurobiol 48(2): 75-86.

3. Lei, L., Sonabend, A. M., Guarnieri, P., Soderquist, C., Ludwig, T., Rosenfeld, S., Bruce, J. N. and Canoll, P. (2011). Glioblastoma models reveal the connection between adult glial progenitors and the proneural phenotype. PLoS One 6(5): e20041.