角膜细胞分离

遇上实验需要的角膜缘间充质基质该怎么提取，以下是我们的提取步骤,点个关注，提取原代不迷路:

准备试剂：

12孔板、微量移液管尖端、60mm细胞培养皿、100 mm细胞培养皿

注射器过滤器0.2μm、10号一次性手术刀刀片、15 mL锥形管

T75培养瓶最好选康宁的，可逆细胞过滤器、细胞过滤器20µm、FACS管（5 mL聚苯乙烯圆底管，Falcon，目录号：352058）、胶原酶A、Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（启达货号：SD0030)

0.25%胰蛋白酶-EDTA、MSCM干细胞培养基（低血清）、FGM成纤维培养基、70%乙醇、0.5 M EDTA、CD90、CD44、小鼠IgG2a，k同种型APC、.细胞角蛋白AE1/AE3、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）.

细胞分离步骤：

1.将角膜缘段置于含有5 mL胶原酶a（2 mg/mL）的60 mm培养皿中，并用手术刀片切割

将角膜缘部分切成更小的部分（2-3块）。在37°C和5%二氧化碳条件下培养以胶原酶过夜消化并获得角膜缘细胞簇。

2.培养后，使用1mL移液管上下吹打，在培养皿内吹打成细胞悬液并在显微镜下观察细胞簇和单细胞的存在，这个细胞簇应该由角膜缘上皮细胞、基质细胞和黑素细胞小众细胞组成（如图1所示）。

注：如果培养和研磨过夜后角膜缘部分不完全消化，则在37°C的同一溶液中用5%CO2再培养2小时，以实现完全消化。相反，组织的过度消化（超过20小时）可能会影响细胞活力和细胞质量。

A.将角膜巩膜缘（左）切成扇形，在前后将每个扇形切除1mm边缘区域（右）。来自Polisetti等人（2019）文献。

B. 不同尺寸角膜缘段在胶原酶中孵育过夜后形成的角膜缘簇和单细胞溶液不同（放大x40倍）。

C. 过滤从单个细胞分离的边缘簇。

D.单细胞需用胰蛋白酶-EDTA消化角膜缘簇并形成角膜缘细胞悬浮液

3.使用孔径为20µm的细胞过滤器将角膜缘细胞簇从单个细胞中分离出来，未通过细胞过滤器的细胞和待保留的簇用DPBS清洗过滤器两次，以移除任何剩余的单个细胞。反转滤网，将其放在一个60毫米的盘子上。加入0.25%胰蛋白酶-EDTA（5 mL）将簇冲洗到培养皿中，并在37°C下孵育10-15分钟，以将簇解离成单个细胞。

注：可以使用37µm可逆式细胞过滤器代替20µm细胞过滤器。单细胞悬浮液离心后获得角膜缘成纤维细胞，使用FGM （启达生物：P6001)（图2)直接培养即可，得到角膜成纤维细胞就是这么简单。

再继续角膜基质细胞提取：

4.孵育完成后，用1mL移液管上下吹打，研制细胞悬浮液。直到看到

显微镜下的细胞悬浮液停止吹打。添加5 mL含有10%FBS的预热DMEM（37°C水浴）来抑制胰蛋白酶消化。将细胞悬浮液转移到15mL离心管，以200×g离心5分钟。

注：如果在孵育和研磨15分钟后簇不完全解离，则在在37°C和5%CO2的胶原酶中再搅拌5分钟，以实现完全解离。相反，簇的长时间消化可能会对细胞活力和细胞质量产生不利影响。

5. 离心后，通过使用P200移液管加200µL FACS缓冲液（见配方3）进行荧光激活细胞分选（FACS）

1.将细胞悬浮液转移到FACS管（100µL/管）中，并加入小鼠APC缀合的抗人将CD90抗体（5µL/106个细胞）连接到一根试管，并在4°C下将IgG2a同种型APC连接到另一根试管。轻轻地使样品涡旋，并在冰上孵育45分钟，每隔15分钟轻敲一次。

注：如果细胞数较高，即超过10^6个细胞，则按照细胞数量调整抗体的体积和浓度

2.培养后，向每个FACS管中加入1mL FACS缓冲液，并将细胞以400×g离心5min.重复洗涤两次。

3.洗涤后，加入500µL含有DAPI的FACS缓冲液（1:5000），以排除死细胞，然后继续

使用FACS Aria II分类器进行流式分拣（参考Polisetti等人，2022）

6. 角膜缘间充质基质细胞的培养

1.将分选的CD90+LMSC播种到12孔板的孔上。

注：每个角膜缘的CD90+细胞数量（150–900）因样本而异。CD90-群体主要含有LEPC，可以使用细胞类型特异性培养基来富集LEPC（参考Polisetti等人，2020）。

2.在37°C和5%CO2的MSCM（启达货号：P2001)(图三）完全培养基中培养LMSC。每2天换液一次。

3.通过相差显微镜观察LMSC的形态。LMSC表现为纺锤形，具有突出核仁的细长细胞（图4）。

7.角膜缘间充质基质细胞的传代

1当细胞生长到80-85%以上的汇合度开始准备传代；

2.使用DPBS洗涤细胞，并加入1mL胰蛋白酶-EDTA（0.25%；在水浴中在37°C下预热）。

常温条件下培养1-3分钟。

3.显微镜下观察细胞变得椭圆透亮后，轻拍细胞瓶壁，加入2mL MSCM完全培养基以抑制胰蛋白酶的作用，并充分混合。

4.将细胞悬浮液转移到15mL试管中，并以200×g离心5分钟。重新悬浮细胞颗粒在MSCM（启达货号：P2001)完全培养基中，并使用血细胞仪计数总细胞数。

5.将细胞用于实验或用于传代培养及冻存。

注：过度融合（超过85%）和延长胰蛋白酶消化（超过5分钟）会产生不利影响，在细胞培养过程中影响细胞活力和细胞质量。细胞传代率始终为80%至85%汇合度同时应避免在胰蛋白酶中长时间孵育。