B细胞的提取和操作

B细胞在免疫发展中发挥中心作用。他们在骨髓中最初进入血液作为幼稚B细胞，其可以迁移到淋巴组织，诸如脾，淋巴结，扁桃体，为进一步发展，一些幼稚B细胞迁移到淋巴滤泡，其中生发中心B细胞可以分化成记忆B细胞和plasmablasts(PBS)/浆细胞(PC)的。虽然大多数PBS/PC最终进入血液，少数最终驻留在骨髓经受终端分化为长寿命的浆细胞。

先上B细胞的提取吧：

1. 静脉取血 2ml，加入含肝素溶液(50ug／ml血样本)的试管中，混匀，使血液抗凝。用 PBS溶液1：1稀释。

2、吸取 2ml 淋巴细胞分离液（启达生物，货号：SD0059）置于刻度离心管中，然后将离心管倾斜 45°角，用毛细滴管将稀释的全血沿管壁缓慢加至分离液上面，应注意保持两者界面清晰。

3、在 18℃～20℃下，使用水平离心机以 1500r/min 离心 20min。

4、小心取出离心管，用1ml移液器缓慢吸取第二层淋巴细胞，配平再次离心，若有红细胞，可多用PBS洗涤一次。

5、弃上清，将沉淀细胞悬于培养基中备用。

再来B细胞的纯化：

(a) 取1mg羧基磁珠(约100μl磁悬液，取用前超声充分混匀)于1.5ml Ep管中，涡旋振荡5-10min；

(b)取适量磁珠悬液，用 20 倍体积的 PBS+0.2%BSA 溶液重悬细胞后，置磁架上 5min，待磁珠完全被吸附

备注：（磁珠与单个核细胞或全血的比例为：0.5mg 磁珠/1×107 个单个核细胞或 1ml 全血）;

（c)用移液器小心吸去上清，以去除在储存过程中从磁珠上脱落的二抗。用 100ul PBS+0.2%BSA 溶液重悬磁珠。加入一抗（一抗与磁珠的比例为：5ug 一抗/1mg 磁珠）混合均匀，室温条件，在样品混合仪上活化30min

(D)加入 2ml PBS+1.2%BSA 溶液，再置磁架上 5min。吸去上清，以去除未与二抗结合的一抗。重复操作一次。用 100ul PBS+0.2%BSA 溶液重悬磁珠。

（E）用B细胞完全培养基（启达生物，货号：P3901)调整待分离细胞的浓度为 1×107 细胞/ml，将细胞加入磁珠悬液中，置室温 15min，中间轻微晃动一次。然后置磁架上 10min。吸去上清。

(F)用B细胞完全培养基重悬磁珠结合的细胞后直接进行培养。

好啦，看下图，B细胞提取成功啦！

    Bcells 培养第一天      Bcells 培养第7天