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肿瘤原代的纯化培养，你学会了吗？
来源：启达生物 浏览量：370 发布时间：2023-09-14
肿瘤原代提取后总会发现有杂细胞在默默的生长，混杂的细胞会直接影响实验结果，而利用体外培养细胞进行实验研究时，为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性和可重复性，要求采用单一种类细胞来进行实验，这样才能对某一细胞的功能、形态等变化进行一系列研究，于是我们必须要将细胞进行纯化，以维持实验结果的统一性和可验证性。
因肿瘤本身保持的无规则与无限的生长性，克隆化纯化法是肿瘤原代纯化首选的方法，其分为：毛细管法、有限稀释法 、平皿克隆分离法、软琼脂克隆分离法、单细胞显微操作法等
1.毛细管法:
将一定量的细胞悬液（如1*10^5/mL或更低）稀释至10个细胞/mL，取10mL稀释的细胞悬液，用直径为0.5mm，长为8mm的毛细玻璃管若干（30～50只），在负压作用下，使悬液吸入各毛细管中，在倒镜下检查出每管只进入一个细胞的毛细管，然后放入适应性培养基或有饲养层细胞的培养瓶（或培养板）内，在CO2培养箱中培养，由一个细胞在毛细管繁殖后，并向管外扩展，并形成单个克隆的细胞群体。
食管癌细胞初代培养 纯化后的食管癌细胞
2.有限稀释法：
（1）取对数生长期的细胞制成悬液(贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打分散制成)，经台盼蓝染色计数，测定活细胞数及浓度（细胞存活率及单个细胞百分率应高于90%以上）。
（2）将细胞悬液在试管中稀释，用培养基将细胞稀释至50个细胞/mL、10个细胞/mL、5个细胞/mL，将3种稀释度的细胞分别接种于96孔板中，每孔为0.1mL，于37℃ 5%CO2下培养。
（3）次日在倒置显微镜下观察培养板各孔中的细胞数，挑选只含一个细胞的孔，做好标记并补加0.1mL培养液继续培养。
（4）培养期间，视pH值的变化决定是否换液或补加培养液，一周左右，孔中有明显克隆出现，待长至孔底面的1/3～1/2时，可用消化法将96孔中的单一克隆的细胞分别移至24孔板中进行扩大培养。
3.平皿克隆分离法：
（1）将对数生长期细胞制备单个细胞悬液（悬浮细胞用吸管吹打分散，贴壁细胞先用0.25%胰蛋白酶消化后，再用培养基吹打分散）计数并用培养基调整细胞浓度，使5mL培养液内含有50～200个细胞（细胞存活率及单个细胞百分率应大于90%以上）。
（2）将上述细胞悬液迅速移入60mm平皿中，在37℃ 5% CO2下培养1周或更长。若有明显的克隆形成时方可进行克隆分离，方法有两种：
① 套环法：在倒置显微镜下观察克隆形成的情况， 标记单个克隆周边，吸干培养基，用涂有少量无菌硅脂的无菌金属套环，套住标记的克隆，在套环内滴加少量0.25%胰蛋白酶，待细胞脱离时，用注射器针头轻轻吹打分散后，转入小平皿或24孔板或6孔板中扩大培养。
② 玻片法：在接种细胞悬液前，预先在60mm平皿中放入无菌小玻片，加入细胞悬液，培养一定时间后，在倒置显微镜下标记上含一个克隆的玻片，然后用无菌镊子取出标记玻片转入24孔培养板中继续培养。
4.软琼脂克隆分离法：
此方法仅用于悬浮培养的类淋巴细胞或恶性程度高的贴壁细胞，比较好消化的细胞在软琼脂中不能形成克隆。
（1）将对数生长期的细胞制成单个细胞悬液(贴壁细胞用0.25%胰蛋白酶消化使之分散成单个细胞)作活细胞计数。调整细胞浓度至1×10^6细胞一升，然后根据实验要求再作梯倍稀释。通常以1~5×10^4个细胞一升为佳。
（2）制备底层琼脂取5%琼脂置沸水中，使琼脂完全溶化，取出一份5%琼脂，移入小烧杯中，待冷至50℃，迅速加入9份预温37℃的新鲜培养液（即成为0.5%琼脂），混匀后立即注入24孔培养板中，每孔含0.5% 琼脂0.8mL，置室温使琼脂凝固备用。
（3）制备上层琼脂取37℃保温的、不同浓度的细胞悬液9.4mL，移入小烧杯中，加入50℃ 5% 琼脂0.6mL迅速混匀，即配成0.3%琼脂培养基，立即浇入铺有底层琼脂的24孔培养板中，每孔0.8ml，置室温使琼脂凝固。
（4）于37℃ 5% CO2下培养1~2周或更长，若需培养更长时间可补加0.8mL/孔含琼脂的培养液，待有明显集落形成为止。
（5）集落（克隆）计数：在倒置显微镜下观察并计数直径大于75μm或含有50个细胞以上的克隆。
5．单细胞显微操作法
借助显微操纵器，在显微镜监控下将单个细胞逐个吸出，移入含有饲养层细胞的培养板中进行培养。本法准确性好，如无显微操纵器可自制毛细吸管替代
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贴壁细胞悬浮培养的小妙招
