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值得关注,类器官操作的Protocol

来源:启达生物  浏览量:745  发布时间:2023-04-17

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组织培养类器官分离:

添加含有双抗、庆大霉素的类器官缓冲液浸泡,用眼科镊刮去组织血液,粘膜,肠绒毛等。在培养皿中用类器官缓冲液清洗三次(每次更换培养皿)后剪碎,剪成大约1mm3的组织块

1.为了促进 BME 的去除,将组织置入15ml离心管,加入 10 mL 冰预冷的 DMEM/F12培养基 4°C 条件下以 200 g 的转速离心 5 分钟。

2.吸出上清液,采用 TrypLE 或机械破碎来分解类器官,前者适用于头颈部和紧实的乳腺、结肠、胰腺和肝脏类器官,后者适用于卵巢和囊性的乳腺、结肠、胰腺和肝脏类器官

机械破碎法:

将沉淀重悬在 3 mL DMEM/F12 培养基中。在移液器上装上 P1000 带滤芯吸头和(不带滤芯)P10 吸头,上下吹打类器官悬液 30 -50次。枪头紧靠管的底部来产生更大压力,有助于类器官的分解。

TrypLE消化法:

1. 将沉淀重悬在 3-5 mL TrypLE 中,上下吹打并在 37°C 条件下孵育,直至类器官分解。在移液器上装上 P1000 带滤芯吸头和(不带滤芯)P10 吸头,每 3~5 分钟上下吹打 ≥ 10 次,以促进类器官的分解。密切监控消化过程,尽量缩短 TrypLE 的孵育时间不同类型或者量的组织,消化时间不同,消化时间不宜过长。例如穿刺样本为 10 min,小的组织碎片团为 30 min~1 h。

2. 使用 P1000 移液器上下吹打 10~20 次,进一步促进组织破碎。从顶部加入10ml含有10%KOSR-SerumReplacer™D/F培养基,并在 4℃ 下以 200 g 离心 5 分钟,对细胞进行清洗。

3. 将沉淀重悬在 含有10%KOSR-SerumReplacer™ 10 mL培养基中,并用 70~100 μm 细胞滤网进行过滤。

4. 对重悬和过滤后的细胞进行离心,在 4°C 下以 200 g 离心 5 分钟

注意的小细节:

如果过筛后的细胞沉淀呈红色,可能有血红细胞污染,建议加入 5 mL 红细胞裂解液 4°C 处理 5 分钟。完成裂解后,在 15 mL 管中加满 PBS 清洗一次,然后在 4°C 下 500 g 离心 3 分钟。

类器官培养:

将消化好的细胞悬液计数,按照1-2万细胞每孔计算所需的细胞数,根据计算好的体积吸取细胞悬液加入预冷的1.5 mL离心管中,补齐预冷的培养基至所需体积,将预冷后的细胞悬液加入等体积的Matrigel基质胶中轻轻混匀(全程冰上操作),然后将细胞与基质胶的混合液按照40 μL/孔不低于10,000 个细胞/40ul)接种于24孔板。将接种好的培养板放入培养箱至少30 min,待Matrigel完全凝固,然后沿24孔壁每孔缓慢加入500 μL预先恢复至室温的类器官培养基,3天后镜下观察类器官形成情况,粒径大于50 μm即认为类器官已经形成,每5天更换一次培养基进行培养,持续观察类器官大小,镜下观察大部分类器官大小均大于50 μm且大小不再增大即可收集类器官进行后续实验。

 

3. 类器官传代

待器官形成并且不再增殖后,收集类器官,

1. 加入组织消化液37°消化10-15min。

2. 使用KOSR-SerumReplacer™血清替代物或者0.2%的BSA溶液终止消化

3. 使用100μm孔径的筛网进行过滤

4. 1500 rpm离心3 min,弃上清,使用HBSS重悬沉淀后1500 rpm再次离心3 min;加入预冷的类器官培养基进行重悬,计数,按照培养步骤操作继续培养。

 

类器官冻存:采用启达生物组织/类器官冻存液直接冻存(货号:SD0055)冻存后需程序降温,第二天移入液氮。

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