蛋白质印迹法实验步骤（荧光）

A. 溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

准备好1X磷酸盐缓冲液 (PBS),1X Tris盐缓冲液（TBS）,1X SDS样品缓冲液：

通过添加1/10体积的30XDTT至1体积的3XSDS上样缓冲液，制备新鲜的3X还原上样缓冲液。用dH2O稀释至1X。

10X Tris-GlycineSDS电泳缓冲液：要制备1L1X

电泳缓冲液：向900mldH2O中添加100ml 10X电泳缓冲液，然后混匀。

10X Tris-Glycine 转移缓冲液：要制备1L1X转移缓冲液，向200ml甲醇+700ml dH2O中添加100ml10X转移缓冲液，然后混匀。

含 Tween20的 10X Tris盐缓冲液(TBST-10X)：要制备1L 1XTBST：向900mldH2O中添加100ml 10X TBST，然后混匀。

脱脂奶粉：

封闭缓冲液：含5%w/v 脱脂奶粉的1XTBS；要制备150 ml，向150ml 1X TBS中添加7.5g脱脂奶粉并充分混匀。Tween20不应添加至封闭缓冲液中，因为它具有自发荧光并且能够增加非特异性背景。在封闭步骤之后，随后的稀释剂缓冲液中再添加Tween20。

洗涤缓冲液：1XTBST。

牛血清白蛋白 (BSA)

一抗稀释缓冲液：如一抗数据表上所示，含5%BSA或5%脱脂奶粉的1X TBST；要制备20ml，向20ml 1X TBST中添加1.0gBSA或脱脂奶粉并充分混匀。

二抗稀释缓冲液：含5%脱脂奶粉的1XTBST；要制备20ml，向20ml 1X TBST中添加1.0g脱脂奶粉并充分混匀。（二抗选择；抗兔或抗小鼠）。

预染蛋白质标准品，宽范围(11-190kDa)：。

印迹膜和纸：硝酸纤维素膜，通常推荐0.2 µm孔径。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

1.添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。

2.从培养物中吸出培养基；使用冷的1XPBS 洗涤细胞；吸取。

3.加入1X SDS样品缓冲液（6孔板每孔100µl或10cm直径的平板每平板500µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。

超声处理10–15秒以完成细胞裂解并剪切DNA（以降低样品粘度）。

4.取20µl样品，在95–100°C下加热5分钟；放在冰上冷却。

5.微量离心机内离心5分钟。

6.上样20µl到SDS-PAGE凝胶 (10cm x 10cm) 上。

注：建议将预染蛋白分子量标准品（10µl/泳道）上样以验证电转移和确定分子量。预染标准品在近红外波长范围内具有自发荧光。

7.电转至硝酸纤维素膜。

C.膜封闭和抗体孵育

注：容量适用于 10cm x 10cm (100cm2)的膜；对于不同尺寸的膜，请相应调整容量，转移之后，在室温下用25mlTBS将硝酸纤维素膜洗涤5分钟。

将膜置于25ml封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。

关键步骤：切勿在封闭缓冲液中加入 Tween 20。

8.用15mlTBST洗涤三次，每次5分钟。

9.将膜和一抗（稀释到相对的浓度）置于10ml一抗稀释缓冲液中在4°C下孵育过夜并不时轻轻晃动。

用15mlTBST洗涤三次，每次5分钟。

将膜与荧光素偶联的二抗（稀释度为 1:5000-1:25,000的1mg/ml原液）在室温下于10ml 二抗稀释缓冲液中孵育1小时，并不时轻轻晃动。

用15mlTBST洗涤三次，每次5分钟。

D. 蛋白质检测

将膜上多余的TBST沥干，可使其干燥。

关键步骤：对于荧光染色，必须确保膜干燥。

请使用合适的荧光扫描仪扫描膜。