实用干货：小鼠的肺微血管内皮细胞提取步鄹

1.小鼠处死与取材：

将小鼠用颈椎脱臼法或过量麻醉剂（如戊巴比妥钠，剂量为50-100mg/kg体重）处死，迅速将其仰卧固定于解剖板上。

用75%酒精消毒腹部皮肤，沿腹部正中线剪开皮肤和腹壁，暴露胸腔。

用眼科剪小心剪开胸腔，充分暴露心脏和肺脏。

用注射器经右心室向肺动脉内注入约5ml无菌PBS，直至肺脏变白，以冲洗掉肺内的血液。

用眼科剪小心剪下肺脏，放入盛有预冷无菌PBS的培养皿中，轻轻漂洗2-3次，去除表面的血迹和杂质。

2.组织剪碎与消化：

将漂洗后的肺脏转移至新的无菌培养皿中，用眼科剪将肺组织剪成约1mm³的小块。

将剪碎的肺组织块转移至离心管中，加入适量的胶原酶Ⅱ溶液（每克肺组织约加入5-10ml），轻轻混匀。

将离心管用封口膜密封好置于37℃水浴中消化30-60min，期间每隔5-10min轻轻振荡一次，使消化充分。

3.细胞悬液制备：

消化结束后，将离心管取出，800-1000r/min离心5 - 10min，弃去上清液。

向沉淀中加入适量的红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温静置5-10min，以裂解红细胞。

再次800-1000r/min离心5min，弃去上清液。

用适量的内皮细胞培养基重悬沉淀，然后依次通过70μm和40μm的细胞筛，去除较大的组织碎片，得到单细胞悬液。

4.细胞接种与培养：

将单细胞悬液转移至离心管中，800-1000r/min离心5 min，弃去上清液。

用适量的内皮细胞培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度至（1 -2）×10^6cells/ml。

将细胞悬液接种于预先包被有明胶或纤连蛋白的培养瓶或培养板中，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。

培养12小时后，轻轻倒掉培养液，用无菌PBS轻轻漂洗2-3次，去除未贴壁的细胞，然后加入新鲜的内皮细胞培养基继续培养。

1.细胞观察：
在培养过程中，每天在倒置显微镜下观察细胞的生长状态和形态，记录细胞的贴壁情况、生长速度、形态变化等。正常的肺微血管内皮细胞呈铺路石样外观。

2.细胞鉴定：
培养至细胞融合度达到70%-80%时，可进行细胞鉴定。常用的鉴定方法包括免疫荧光染色检测内皮细胞特异性标志物（如CD31、vWF等）、摄取乙酰化低密度脂蛋白（Ac - LDL）等。

以上步骤仅为一般的小鼠肺微血管内皮细胞提取方法，实际操作中可根据具体实验要求和实验室条件进行适当调整。

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