细胞培养无小事（三）贴壁细胞的消化方法

贴壁细胞的消化方法介绍

如何消化让细胞生长的更好，养细胞关键还是在消化，以下介绍几种细胞的消化方法

一、酶消化法。

1、胰酶。这是用得最多的。一般浓度在0.25-0.5%。消化的时间根据细胞种类、操作手法，温度等因素而变化，从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶，37℃一般在消化单层贴壁的细胞一般1-5分钟就足够了，用血清或者含血清的完全培养基终止。

2、胶原酶。一般用于原代细胞消化，这种方法作用温和，对细胞损伤较小，消化的时间也略长，不推荐的原因是胶原酶有点小贵而且培养细胞株感觉没有多大的必要。

二、离子螯合剂：不破坏细胞表面分子，仅与CAMs螯合，因此，如果检测细胞表面分子的话，尽量，甚至是一定不要用酶消化法。

1、EDTA。一般浓度在0.02%左右，使用它来消化细胞时，注意它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶，而且它不能被终和，因此，消化下来的细胞一定要洗一遍。

三、物理法。直接吹打或用细胞刮刀，贴壁很牢的细胞可以使用这个方法，吹打和刮刀都会给细胞造成严重的损伤，建议不到万不得已不要使用此法。

四、冷冻法。采用细胞冷冻后收缩的原理，从而使细胞从培养瓶上脱落。优点：对细胞损伤小，不需要中止或洗细胞，方便，不需要另外配制消化液。特别适用那些贴壁不是特别紧，又特别娇气的细胞。缺点：细胞常成小片脱落，重新铺板后细胞生长会有点聚团。常用于间充质干细胞、DC细胞的消化，具体过程是：1、用较多的4℃的PBS洗涤一遍细胞，再加入适量的 4℃的PBS，静置操作台上，很快细胞受冷皱缩小片脱落，3、轻轻吹打，细胞即完全脱落，4、按一定比例传代。

细胞消化难题：

1，成团、絮状：

消化液里加入edta可以减少细胞成团的现象，血清可以终止胰酶的作用，越好的血清使用的效价更高，用胰酶消化后加血清终止，如果消化液中加入了edta的话，就要将消化液倒干净，如果细胞贴壁要求不是很严格的话，一般不需要进行离心。

比如说4T1细胞，这种细胞的贴壁能力天生很强，用0.5%胰酶(含0.1%EDTA)一般要消化10~12min。用PBS洗涤时要洗净残余的培养基，加入胰酶后在培养箱中消化(避免细胞室温下受损以及在此温度时胰酶活性最强)至细胞收缩变圆(可显微镜下观察)且有少许细胞脱落(呈流沙状)，随后立即弃去胰酶(如果脱落的细胞很多且需要大量细胞实验，则不能弃去胰酶)，加入培养基轻轻弹散(不能用无血清培养基或者PBS替代，否则细胞聚集成团块或絮状)。

也可以用2%利多卡因消化5-8分钟，然后再弃去。

消化过度怎么办？

马上用培养基中和，收集全部的细胞到无菌的离心管中800RPM 3分钟。弃上清，用全培重悬，换新的培养瓶继续培养，状态不好的细胞在培养的过程中会死亡脱落，在换液的时候可以清除掉。