解读文献:类器官培养与生物学医学的应用

本文为文献解读，全文阅读大约需要10分钟

类器官培养是一种新兴的3D培养技术，已经产生了来源于各种器官和组织的类器官，如大脑、肺、心脏、肝脏和肾脏。与传统的二维培养相比，类器官培养系统具有保存亲代基因表达和突变特征，以及在体外长期保持亲代细胞功能和生物学特性的独特优势。类器官的所有这些特征为药物发现、大规模药物筛选和精准医学开辟了新的机会。类器官的另一个主要应用是疾病建模，尤其是各种难以在体外建模的遗传性疾病，已经通过结合基因组编辑技术用类器官建模。在此，我们介绍了类有机物技术领域的发展和最新进展。

类器官的研究可以追溯到1907年，当时Wilson等人在体外条件下培养机械解离的海绵细胞以形成功能生物。1自那以来的几十年里，类器官研究主要通过细胞的分离和重组进行。1975年，一项研究培育了原代人类角质形成细胞和3T3成纤维细胞，以产生类似于人类表皮的分层鳞状上皮集落。2到20世纪80年代，第一批多能干细胞（PSCs）从小鼠胚胎中分离出来，并由人类获得，3干细胞技术的发展和进步为类器官领域提供了新的思路。2009年，肠道成体干细胞（ASCs）在体外培养，形成具有隐窝绒毛结构的小肠类器官，4这是类器官领域的一个里程碑式事件，证明了干细胞在体内分化为类似器官的空间结构的潜力。从那时起，类器官培养技术蓬勃发展，并建立了衍生自各种器官的类器官，如大脑、视网膜、肺、胃、肝、胆管、胰腺、和肾脏。

三维（3D）培养技术的快速发展在实现类器官培养方面发挥着至关重要的作用。体内细胞位于复杂的内部环境中，它们受到多种信号和相互作用的影响，以建立、维持和调节细胞表型和特定功能。二维（2D）培养的细胞未能再现体内正常的细胞形态和相互作用。在2D系统中培养的分离组织细胞逐渐失去形态，变得扁平、异常分裂，并影响细胞分化表型。21，22 2D附着往往导致细胞失去其原始形状和分级结构，并影响到细胞-细胞和细胞-细胞外信号转导和相互作用，导致细胞不能正确地再现组织或器官中存在的细胞功能和行为。23 2D肿瘤细胞系在长期培养过程中逐渐失去其异质性。同时，长期传代容易发生交叉污染。已经证实，细胞系的基因组学和代谢组学与长期传代后的原始肿瘤有显著差异。24 3D培养系统可以模拟细胞在活体中生活的物理化学微环境以及细胞间和细胞外基质的相互作用。25在3D系统中培养的细胞可以更好地表现复杂的结构和特异性细胞的细胞功能，与亲本高度匹配，并保持亲本的遗传稳定性和染色质异质性。这些细胞可以在1-2周内快速扩增，并可稳定地传代和冷冻保存。

类器官技术为开发更接近现实生理和病理生理状态的新模型铺平了道路。在这篇综述中，我们介绍了类器官领域的发展和最新进展，并描述了类器官的主要细胞来源和培养方法。我们重点介绍了类器官在基础生物学和临床研究中的应用，如疾病建模和精确治疗，并强调了它们的局限性和未来前景。

一、类器官形成主要有以下几类：

PSC衍生类器官；

ASC衍生类器官；

肿瘤细胞衍生类器官；

多谱系类器官；

二、类器官的培养方法：

Clevers小组开发的浸没培养是类器官最广泛使用的培养方法。在该方案中，将细胞或细胞簇嵌入细胞外基质（ECM）凝胶中，然后将细胞和基质凝胶的混合物放入培养皿中形成圆顶，并添加培养基以浸没圆顶。ECM凝胶起着结构支持和提供ECM信号的作用，常见的ECM凝胶包括基底膜提取物、Matrigel和Geltrex。用于浸没培养的培养基的主要成分由基础，生长因子，刺激因子，抗生素等组成，当从不同组织形成类器官时，培养基组分不同，需要添加或去除哪些特定因子通常取决于它们来源的组织对相应信号或激素的需求。

1、Ali系统培养：

类器官的3D培养条件可以使用由Ootani等人101首次提出的用于建立胰腺和胃肠道类器官的ALI技术来实现。将机械分离的组织碎片均匀地包埋在胶原凝胶中，将混合物平放在下面有多孔膜的内培养皿中，并将混合物的顶部暴露于空气中。将培养基加入外培养皿中。Kuo的团队使用ALI方法建立了各种患者来源的肿瘤样体，包括一些罕见的肿瘤类型，如胆管壶腹腺癌。38 ALI培养系统结合了两个培养皿，可以同时支持类器官和基质细胞的生长。值得注意的是，用这种方法形成的类器官能够保存功能性肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），可以模拟出复杂的肿瘤免疫环境。

2、类器官芯片培养系统

芯片上组织是一种微流体细胞培养设备，可以准确控制细胞生长的生物物理和生物化学环境，模拟细胞和微环境条件，以及组织间和多器官的相互作用，用于疾病建模和研究相关器官的功能；

尽管芯片上的有机物与类器官有着根本的区别，但类器官技术和芯片上有机物相结合产生的芯片上的类器官可以弥补这两种技术的不足，从而更好地作为模拟靶器官组织关键特征的更有效的临床前模型。芯片上的器官细胞是随机自发地自组织成3D结构的，这与精心设计的芯片上的组织不同。109目前，许多研究已经确定了大脑、心脏、胃肠道、肝脏和胰腺的芯片上器官。110-116 Cho等人110开发了一种基于PDMS芯片的大脑芯片上器官，该系统可以增加氧气供应并促进营养物/废物交换，以减少类器官细胞的死亡。值得注意的是，这种培养系统可以形成成熟的大脑类器官，并用于监测整个人类大脑的发育。最近的一项研究表明，芯片上的类器官系统可以在小肠类器官的管腔中产生缺氧梯度，并维持肠道微生物屏障。

除了上述培养方法外，还可以通过悬滴和旋转培养方法制备类器官的3D系统。悬滴法利用重力和表面张力将细胞和特定培养基液滴的混合物悬挂在平板上。118旋转培养法可以通过不断旋转或搅拌细胞来防止细胞沉降，并提高营养和氧气的吸收，这已被用于大脑和视网膜类器官的形成，120 Jacob等人121产生了患者来源的胶质母细胞瘤类器官，保留了组织学和遗传学特征以及部分微血管和免疫微环境。

类器官的4个生物医学应用

1. 构建遗传疾病类器官

类器官可以在体外模拟器官的发育，可用于建模和研究器官特异性遗传疾病的机制；比如，肝类器官是由α1-抗胰蛋白酶缺乏症患者产生的，发现A1AT蛋白聚集在类器官细胞中，这可能代表了α1-抗蛋白酶缺乏症的关键病理和病理生理特征。其他肝胆遗传性疾病，包括Alagille综合征、Wilson病和Wolman病，已用肝胆类器官建模。胰岛类器官已被用于模拟胰岛素分泌相关的遗传疾病，如Wolfram综合征和先天性高胰岛素血症等。

Kim等人通过CRISPR-Cas9技术编辑了iPSC衍生的肾脏类器官，以生成GLA突变的Fabry肾病模型，其应用范围从研究病理生理学到探索Fabry肾病的新治疗方案。制备源自HAND1或NKX2-5敲除iPSC系的心脏类器官，以模拟发育不全左心综合征，妊娠前糖尿病诱导的先天性心脏缺陷也可通过人类心脏类器官进行模拟；来源于神经外胚层的器官遗传病也可通过类器官进行建模；视网膜类器官已被用作建模和研究遗传性视网膜疾病（如视网膜色素变性和Leber先天性黑蒙）机制的有力工具。

2. 构建传染病疾病类器官

由于传染源通常会感染特定的物种或细胞类型，在研究这些疾病的发病机制和发展时，人类模型优于动物模型,Ettayebi等人首先成功地用源自人类肠道类器官的上皮单层在体外培养了人类诺如病毒，他们优化了培养系统，使其能够培养多种菌株。已经用类器官建立了流感病毒、人类轮状病毒和BK病毒的培养系统;

尽管在治疗方面取得了进展，但病毒感染引起的肝脏疾病仍然是中国的一个国家健康问题。当肝炎病毒入侵和攻击肝细胞时，免疫反应被激活，杀死病毒和病毒感染的肝细胞，导致肝实质细胞变性和坏死，并伴有反应性基质组织增生，导致胶原纤维在肝脏中积聚,人类肝脏类器官已成为研究肝炎病毒感染的先进工具，几个实验室已经产生了感染乙型、丙型肝炎的肝脏类器官，和E病毒。最近的研究表明，当来自健康供体的肝脏类器官与重组病毒或HBV患者的血清共同培养时，类器官被感染，病毒活性增强。

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是2019年冠状病毒病（新冠肺炎）的病原体，通常会导致发烧、咳嗽等中度呼吸道疾病，甚至急性呼吸道综合征。目前已生成肺泡肺气道和支气管类器官，用于模拟体内SARS-CoV 2感染，研究新冠肺炎相关的病理生理学，此外，新冠肺炎还导致肺外疾病，包括胃肠和神经症状，以及肝肾损伤，相应的类有机物已应用于SARS-CoV-2相关研究。

类器官模型在感染生物学中的应用不仅限于病毒研究，还可以用于研究细菌和原生动物寄生虫。已经建立了隐孢子虫感染的人类小肠和肺类器官。同样，通过血脑屏障类器官探索了血脑屏障与恶性疟原虫和莱姆氏神经相关病之间的关系，最近的一项研究表明，Hp感染可以激活NF-κB信号通路，并上调RAS蛋白激活因子样2（RASAL2）的表达，以促进胃肿瘤细胞的增殖。RASAL2的下调可显著抑制胃类肿瘤的生长。185伤寒沙门氏菌感染的小鼠胆囊类器官有助于恶性转化（TP53突变和c-MYC扩增），并激活AKT和MAPK信号通路，从而促进异常细胞增殖和向肿瘤的转化。

总之，感染生物学的3D类器官模型可以反映病原微生物和宿主细胞之间的相关性和相互作用，为传染病的机制探索、治疗和药物开发提供关键的临床前模型。此外，类器官和致癌病原体共培养系统的建立为进一步研究生物病原体促进肿瘤形成的机制提供了一个先进的平台。

3. 构建代谢性疾病类器官

目前，代谢性疾病对全世界的健康构成严重威胁。然而，缺乏合适的模型限制了对潜在机制和潜在治疗方法的探索。类器官培养技术为该领域的研究提供了新的思路。

肥胖是一种常见的代谢性疾病，其特征是脂肪组织增加，增加患2型糖尿病和NAFLD的风险。脂肪类器官已被用于研究脂肪相关代谢和肥胖模型。

酒精性肝病（ALD）是世界范围内最常见的慢性肝病之一。ALD的初始阶段是酒精性脂肪肝，其特征是肝细胞的脂肪变性。一些患者会发展为酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化，最终可能发展为癌症和肝衰竭。195 Wang等人报告的ALD类器官模型196是通过将人胎肝间充质细胞/人ESC衍生的可膨胀类肝器官与乙醇共培养系统处理而生成的。该模型可以模拟ALD病理生理学的典型特征，包括丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和乳酸脱氢酶的分泌增加；细胞活力和凋亡降低；CYP2E和CYP3A4活性增加；氧化应激增强；炎性细胞因子释放增加；纤维化；以及ECM沉积增加。

4. 肿瘤类器官构建

目前，最常用的肿瘤学模型主要包括人类肿瘤细胞系和患者来源的异种移植物（PDX）模型。然而，这些模型有一些不可避免的缺点。肿瘤细胞系包括原代（源自患者）和永生化肿瘤细胞。虽然原代癌症细胞保留了母代肿瘤的一些特征，但其生长速度慢、寿命短以及肿瘤缺乏复杂性限制了其应用。永生化细胞具有无限的增殖能力，但在长期培养和传代过程中，它们通常不能代表原始肿瘤的表型并失去遗传异质性，这可能会增加临床药物筛选试验的失败率。197 2D培养系统无法模拟体内细胞生长条件，并且2D培养物不能准确地表示肿瘤的异质性。PDX模型是通过将人类肿瘤细胞移植到小鼠体内并促进这些细胞生长和形成肿瘤来构建的。异种移植模型可以保持亲代肿瘤相对完整的生物学特征以及3D结构和肿瘤间质。研究已经成功地产生了几种肿瘤PDX模型，如肺肿瘤、结直肠癌、胰腺肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤和卵巢肿瘤。1982-202然而，一些缺点限制了它们成为优秀的临床前模型。异种移植模型通常是从少数肿瘤组织中建立的，这些组织不能完全继承原发肿瘤的基因突变，并且随着PDX的生长，人类肿瘤的间质逐渐被小鼠间质取代。203许多基于PDX模型的研究结果尚未在人类试验中得到证实。204此外，PDX模型的经济和时间成本较高，但成功率较低。24类肿瘤保留了亲本肿瘤的异质性和组织病理学特征，并在长期培养后保留了其3D结构32，33205-207（表1）。Papaccio等人208报道，患者来源的结肠直肠类肿瘤代表了相应组织的形态学和免疫组织化学特征以及基因组和转录组学特征，并且这些来自不同患者的类肿瘤对抗癌药物的反应各不相同。

用肿瘤类器官重塑肿瘤免疫微环境。肿瘤样品通过切除或活检获得，并解离成单个细胞以形成肿瘤类器官。肿瘤类器官是由肿瘤细胞建立，并通过浸没法与自体T细胞共培养，可以诱导T细胞的特异性抗肿瘤作用，导致类肿瘤的损伤和死亡。随着ALI方法的应用，肿瘤类器官被用作初始细胞材料，生成保存癌相关成纤维细胞和免疫细胞的类肿瘤细胞，可以在体外重现复杂的肿瘤微环境（使用BioRender.com创建）

有机化合物在精确医学中的一个潜在应用是开发个性化癌症治疗。PDO可用于测试不同化疗药物的疗效，并确定对该患者最有效的治疗方法,Khan等人的一篇文章描述了类器官在预测消化系统转移性肿瘤患者对各种化疗药物和靶向药物的反应方面的应用。

由于类器官在靶向治疗理论中的重要作用，类器官也被用于进行靶向药物筛选和发现潜在的治疗靶点。来自三种肿瘤类型患者的卵巢肿瘤类器官已被Phan等人用作高通量筛选平台，以测试对240种蛋白激酶抑制剂的敏感性。

最后，类器官可用于研究环境毒素和其他因素对人体组织的影响。通过将类器官暴露在不同的环境条件下，研究人员可以研究空气污染、有毒化学物质和其他因素对人类健康的影响，并确定减少暴露和预防疾病的个性化策略。