文献总结：克隆形成实验怎么做

克隆形成试验是一种有用的工具，用于测试给定的癌症治疗是否可以降低肿瘤细胞的克隆形成存活率。菌落被定义为至少由50个细胞组成的集群，通常只能在显微镜下确定。克隆形成试验是确定电离辐射治疗后细胞繁殖死亡的首选方法，但也可用于确定其他细胞毒性药物的有效性。以下方案已从已发布的版本中进行了修改（Franken等人，2006年）。

材料和试剂

细胞培养基

磷酸盐缓冲盐水（PBS）(启达生物，货号：SD0029)

胎牛血清(启达生物，货号：SD0200)

胰蛋白酶/EDTA

结晶紫

甲醇

冰醋酸

菌落固定溶液

结晶紫溶液

设备

细胞培养培养皿或六孔板

血细胞仪

立体显微镜

血细胞仪

恒温箱

操作步骤

1.根据参考文献选择自己所需要培养的细胞。

2.取出培养基，然后用10ml PBS冲洗细胞。

3.向细胞中加入4ml 0.25%胰蛋白酶，并在37°C下孵育1-5分钟，直到细胞呈圆形。

4.加入10ml含有10%FBS的培养基，通过移液分离细胞。

5.使用血细胞仪对细胞进行计数。

注意：获得相对准确的细胞数是至关重要的。

6.准备所需的接种浓度，然后将细胞接种到培养皿或6孔板中。

处理前电镀：

1. 收获细胞，并在6孔板上的每个培养皿或每个孔上培养适当数量的细胞，至少一式两份。用于接种的细胞数量应根据处理的侵略性来确定。在37°C的CO2培养箱中培养细胞数小时，并使其附着在培养板/培养皿上。

2. 必要时用化学物质、辐射（如2-10Gy）或两者的组合处理细胞。

3. 将细胞在37°C的CO2培养箱中培养1-3周，直到对照板中的细胞形成大小基本良好的集落（每个集落50个细胞是评分的最低值）。

处理后的镀层：

1. 处理后收获细胞。可以电镀50个或最多50 x 104个细胞。如果治疗效果不清楚，用不同数量的细胞制备系列稀释液。对于放射治疗，细胞可以在治疗后立即接种或稍后重新接种。在重新接种之前，最好将细胞放在冰上。

2. 将细胞在37°C的CO2培养箱中培养1-3周，直到对照板中的细胞形成大小基本良好的菌落（每个菌落50个细胞是评分的最低值）。

固定和染色：

1.取出培养基，然后用10ml PBS冲洗细胞。

2.取出PBS，加入2-3毫升固定溶液，将培养皿/培养板在室温（RT）下放置5分钟。

3.取出固定溶液。

4.加入0.5%结晶紫溶液，在室温下孵育2小时。

5.加入10ml含有10%FBS的培养基，通过移液分离细胞。

6.小心地去除结晶紫，将盘子浸入自来水中冲洗掉结晶紫。

7.在室温下，将碗碟/盘子放在桌布上风干几天。

数据分析：

1.用立体显微镜计数菌落数。

2.计算电镀效率（PE）和存活率（SF）。

PE=形成的菌落数/接种的细胞数x 100%

SF=处理后形成的菌落数/接种的细胞数x PE

菌落固定溶液配方

乙酸/甲醇1:7（体积/体积）

结晶紫0.5%溶液

参考文献：Yang, X. (2012). Clonogenic Assay. Bio-protocol 2(10): e187. DOI: 10.21769/BioProtoc.187.