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内皮成管怎么做,最全的操作步骤来啦

来源:启达生物  浏览量:1967  发布时间:2022-11-17

体内的新血管由三个过程组成:血管生成、动脉生成和血管成。动脉生成涉及重塑现有血管的成熟产生完全发育的功能性动脉取决于内皮细胞衬里和基底层的连续性此外,内皮细胞的大小和形状、交叉点,以及是否存在质膜体的数量也有关系,内皮细胞之间的功能异质性参与控制血管收缩和扩张,血液凝血、纤溶、抗原存在、动脉粥样硬化和分解代谢脂蛋白。

图片1.png 

But,血管是怎么生成的呢?掌握以下几点,轻松搞定血管形成实验:

1. 准备好P3-P5HUVEC细胞,ECGM内皮细胞培养基,基质胶,磷酸盐缓冲盐水,培养耗材

2. 从靶细胞制备条件培养基

3. 为了制备条件培养基(CM),种子靶细胞并生长至30-40%汇合(取决于细胞系的生长速率),用无血清ECGM代替生长培养基(例如 10ml 对于T75组织培养瓶;当存在或不存在抗生素时无关紧要)24小时,然后当细胞在T75组织培养瓶中达到60-80%汇合时收获CM

4. 使0.5ml等分的CM,并存储在-80°C,如果它不是立即使用后收集CM

图片2.png                                                                                         HUVEC(启达货号:CD0290P2

5. 在进行管形成测定之前,去除血清双抗使HUVEC细胞饥饿3-6小时,若是使用T25细胞培养瓶,加5ml左右的基础培养基培养。

6. 在用稀释好Matrigel包被96孔板后,用0.25%EDTA胰蛋白酶消化细胞,细胞脱落后,双倍含有血清的ECGM培养基中和,在室温下通过在1,200rpm离心(276×g 3-4分钟,重悬于2-3ml无血清ECGM中,通过计数细胞测定HUVEC的浓度,并通过上下吹吸数次以4×10 ^5cells/ml用无血清的ECGM重悬HUVEC细胞次以确保均匀的单细胞悬浮 注意:对于稀释Matrigel,应尽可能减少解冻/冻结循环。

7. 充分混匀,同时移取500微升的HUVEC细胞悬浮液到1.5毫升管。使用台式离心机以4,000rpm1,100rcf)旋转细胞3分钟。小心吸出上清液,不要触及细胞沉淀。尽可能多地去除上清液。根据要使用的目标细胞的数量,在1.5毫升管中准备适当数量的HUVEC细胞。

解冻从程序A步骤2收集的靶细胞系的CM0.5ml等分试样,并用胎牛血清补充至终浓度为1%,以在程序B步骤5中重悬HUVEC细胞沉淀。

注意:每个靶细胞系应该重复三次(每个孔需要100μlHUVEC细胞悬浮液)。

用生长因子减少的Matrigel涂覆96孔板

在使用前一天在4℃下融化适当体积的生长因子减少的Matrigel

预冷96孔板和移液器吸头在-20°C 2-3小时

接近HUVEC细胞的血清饥饿结束并且在计数HUVEC细胞之前,在冰上将预冷的96孔板的每孔等分50μl生长因子减少的Matrigel。旋转板直到凝胶均匀分布在整个孔上。避免气泡形成。使其在室温下在水平表面上聚合1小时

HUVEC细胞分配到涂覆的96孔板中

100μl在程序B步骤6中获得的HUVEC细胞悬浮液充分混合到96孔板的标记孔中。将板在37℃5CO 2孵育4-6小时

使用光学显微镜可视化细胞。拍摄毛细管网络的图像,并使用Scion Image软件计算管长度。

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