实验分享：血脑屏障实验的操作步骤

从19世纪末，保罗·埃尔利希在一个实验中发现了这个屏障，后期科学家跟进研究后发现血脑屏障（BBB）对机体发挥着重要作用。BBB结构和功能的完整对于维持神经元功能，使中枢神经系统免受病原体、炎性因子、损伤的影响有重要意义。缺血性脑血管病的发生、发展与BBB结构和功能的破坏密切相关。

一． 实验试剂准备：

1. 准备好无钙镁离子PBS磷酸盐缓冲液，cell systems人脑微血管内皮细胞（货号：ACBRI 376)建议使用无钙镁离子的缓冲液实验.

2. 通过稀释 0.5 mg/mL 纤维素溶液和 0.3 mg/mL 胶原蛋白 IV 溶液，在 1.5 mL 微管中分别使用 1x PBS 至 100 mg/μL 等分，制备 10 μg/mL 胶原蛋白 IV 和 10 μg/mL 纤维素溶液。此后，将两种等分的100μL与1，800μL的1x PBS混合在2 mL微管中，并将其储存在-20°C。也可使用cell systems原代细胞专用包被液（货号：4Z0-201），铺板后静等2分钟，吸掉包被基质，直接铺板细胞，节约时间，简单方便。

3. 预备好培养基，cell systems原代细胞经典培养基(货号：4Z0-500)包含包被液和生长因子，并且不含抗生素。

4. 准备胰酶，在 50 mL 管中稀释 45 mL 的 1x PBS 的 10x 浓缩胰蛋白酶-EDTA 溶液的 5 mL，制备 1x 胰蛋白酶-EDTA 溶液并将其储存在 4°C，也可以cell systems传代套装（货号：4Z0-800),包含PBS，胰酶，胰酶中和液，一套解决所有消化试剂的准备问题。

5. 在 500 mL 玻璃瓶中称量 10 g LB 肉汤，制备 500 mL LB 介质。加入500 mL的消毒水，并高压灭菌。

6. 在 500 mL 玻璃瓶中称量 10 g LB 肉汤和 7.5 g 的琼脂，准备 LB 琼脂。在高压灭菌前加入500 mL的消毒水，不要关闭烧瓶盖。高压灭菌器，让溶液冷却，直到可以接触。

. 二.血脑屏障细胞的生长

1. 使用12 孔板，请将细胞包被液种到孔里。

2. 将板和每个刀片解压在生物安全柜中，并在那里执行进一步步骤。使用消毒钳抓住刀片在其宽基上移动它。

3. 用90μL的10微克/mL胶原蛋白IV和10μg/mL纤维蛋白混合物覆盖每个刀片的多孔膜。之后放入细胞培养箱中孵育24小时，在37°C下孵化。

4. 将 1 mL 的 1x PBS 移入每个刀片，然后用真空泵吸出溶液，用于细胞培养，将刀片洗涤两次。

 注意：若使用cell systems细胞包被液，前三的步骤为：使用移液管将包被液移入孔板里，静等2分钟后吸出，无需清洗，直接执行第四步。

5. 通过在上部移液 0.5 mL 的预热 cell systems经典细胞培养基和下腔室的 1.5 mL 来平衡膜。在具有5%CO2大气的细胞培养箱中，在37°C下孵育30分钟

6. 种子2 x 105人类微血管内皮细胞进入每个上腔，并在细胞培养箱中以37°C孵育12孔板。

7. 使用真空泵从细胞培养液中吸出培养基，然后通过移液 10 mL 的 1x PBS 清洗单层，然后用真空泵对溶液进行吸气。

8. 将5ml的培养基吸出培养瓶，用1x浓缩胰蛋白酶-EDTA完全覆盖细胞。在细胞培养箱中37°C下孵育烧瓶3-5分钟。
注：如果细胞未分离，请轻拍培养瓶让细胞脱落。

9. 加含有血清的培养基中和

10. .在 210 x g下将悬浮液离心 3 分钟，用真空泵去除上清液，用移液器将细胞重新悬浮在 5 mL 的培养基。

11.  将细胞悬浮液的10μL与10μL的0.4%台盼染色剂混合在1.5 mL微管中，使用细胞计数器。将10μL的混合物加入计数室滑块，放入细胞计数器，然后开始计数。

12. .将计数器聚焦在单元格上，使其边缘为深蓝色和中间白色。之后，启动适当的细胞计数程序。

13.要计算每个刀片的体积，请将每刀片获得的 2 x 10^5个单元格的细胞悬浮液的计算浓度分开。

3. 血脑屏障模型的培养

在37°C下孵育12孔板14天。

上腔室的培养基每天更换 0.5 mL，下腔培养基每 2-3 天更换 1.5 mL。在更换培养基之前，请先预热。真空泵吸气，避免产生气泡
注意：小心工作，避免接触膜。

通过显微镜成像细胞，检查细胞的状态，并确定汇合。确保14天后汇合度为100%。

4. 细菌的制备

1. 测量前一天，将大肠杆菌菌株的菌群复苏在LB培养基里。在37°C下孵育培养24小时，在孵育摇床中孵育180rpM

2. 在 4°C 的 LB 琼脂板上培养大肠杆菌菌株。取一个带消毒的采摘管，并将采摘放入具有 3 mL LB 琼脂培养基制备的培养管中。

3. 为每个刀片准备一个 LB 琼脂板，并填充培养皿，将其总体积减半。让他们变成固体，并存储在4°C。

5.  细胞的药物实验

1. 播种后的第14天，用化合物处理细胞或测量转皮电阻（TEER），。

2. 要是由感兴趣的化合物处理细胞，将该化合物稀释到调整好浓度稀释到完全培养基中。将0.5 mL的混合物加入上腔室，将1.5 mL添加到下腔。再次进行培养。之后，通过真空泵吸气和移液进行正常的细胞换液处理。

6. 渗透性测量

1. 为了获得恒定的细菌浓度，用波长为600纳米的光度计测量光密度。用LB培养基在50 mL falcon管中将过夜的细菌溶液稀释至OD600为0.5±0.05。在冰上工作。

2. 向比色皿中加入1毫升LB培养基。启动光度计，将比色杯放入，标记侧朝前。按下底部“空白”，然后测量空白值。

3. 将细菌溶液注入比色杯中，放入比色杯中，然后按压底部样品，测量细菌溶液的密度。在稀释过程中重复测量，直到获得最终浓度。

4. 在生物安全柜中工作，可使用准备好的12孔板和OD600=0.5的细菌溶液处理细菌。仅向每个含有0.5 mL培养基的上腔中添加450µL细菌溶液。

5. 在37°C的培养箱中培养12孔板6小时。

6. 用移液管从每个下腔取50µL培养基样品，方法是用镊子取下插入物。注意不要将培养基从上腔溅到下腔。

7. 将每个样品置于单独的琼脂平板上。将样品滴在平板上，用细胞撒布器划出溶液。

8. 在37°C的培养箱中培养琼脂平板24小时。

9.计算每个平板中的菌落数

CELL SYSTEMS血脑屏障参考文献：

"Cysteinyl leukotriene receptor type 1 antagonist montelukast protects against injury of blood–brain barrier" Zhou et al. Inflammopharmacology, 2019

"Alterations of the Endocannabinoid System in Post-ischemic Endothelial Cells of the Blood Brain Barrier" Thurston (Dissertation) 2019

Exosome-Mediated Transfer of ACE2 (Angiotensin-Converting Enzyme 2) from Endothelial Progenitor Cells Promotes Survival and Function of Endothelial Cell" Wang et al. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2020

"RAGE and CCR7 mediate the transmigration of Zika-infected monocytes through the blood-brain barrier" Costa de Carvalho et al. Immunobiology, 2019

"Binding Heterogeneity of Plasmodium falciparum to Engineered 3D Brain Microvessels Is Mediated by EPCR and ICAM-1" Bernabeu et al. mBio, 2019

"In Vitro Cell Models of the Human Blood-Brain Barrier: Demonstrating the Beneficial Influence of Shear Stress on Brain Microvascular Endothelial Cell Phenotype" Rochfort and Cummins et al. Blood-Brain Barrier, 2018

"Modulation of glucocorticoid receptor in human epileptic endothelial cells impacts drug biotransformation in an in vitro blood–brain barrier model" Ghosh et al. Epilepsia, 2018.