保持免疫荧光做的好看的6个关键步骤

免疫荧光做的好看的6个关键步骤

免疫荧光不可怕，最怕做出来的是糊的，一糊毁所有，细胞免疫荧光高清步骤来啦

1.选对细胞固定液(Fixation) 固定液千千万，不要太花心了 ，因为适合您的细胞固定的也就1.2种，优选多聚甲醛和甲醇(4% 多聚甲醛,室温 15–20 分钟)一定要注意固定时间和温度，因为固定不足会导致细胞解体或信号丢失;固定过度可能破坏抗原表位,需针对目标抗原优化。

2. 灵活运用您的洗涤剂：当需要透化的时候加入0.1–0.3% Triton X-100 和 Tween-20 ,让抗体穿过细胞膜进入胞内。若目标蛋白位于细胞表面,恭喜您，此时清洗根本不需要清洁剂,因为洗涤剂会破坏细胞表面的膜结构。

3. 封闭(Blocking) 用 1–5% BSA 或 5–10% 正常血清(与二抗宿主匹配)封闭 30–60 分钟,占据非特异位点,大幅降低背景荧光。

4. 抗体孵育(Antibody Incubation)

一抗:按说明书优化稀释度(常 1:100–1:1000),4 °C 过夜或室温 1–2 小时,确保特异性结合,也可以采用抗体滴定来确定最低工作浓度，与高抗体剂量的较短孵育时间相比，低抗体浓度的较长孵育时间（例如，4°C，过夜）提供更清晰、更强和更特异性的染色模式，虽然它费时费力，但是真的省钱又好看。

二抗:荧光标记的二抗(如 Alexa Fluor 系列),室温避光孵育 45–60 分钟,注意全程避光以防荧光淬灭。

5.一定不要忘了洗洗洗：

洗涤可能是免疫荧光染色过程中最重要的步骤。相信我，一个人永远不会后悔额外的洗涤步骤！只要使用高质量的抗体，抗原-抗体结合就足够强，可以承受“额外的”洗涤步骤，同时有效去除弱结合或非特异性结合的抗体。洗涤虽然不好玩，让我们想起了餐馆兼职时洗的盘子，但洗涤确实让你的形象从好到好！多增加一两个洗涤步骤，让您有时间享用一杯奶茶。

人肺微血管内皮细胞染色（启达生物:CD5036)

6.染核与封片成像(Nuclear stain & Mounting) 用 DAPI 或 Hoechst 标记细胞核,抗荧光淬灭封片剂封片,尽快用荧光/共聚焦显微镜拍摄;短期可 4 °C 避光保存。

好啦，染色完毕，实验不难吧。